嵌合抗原受體T細胞治療多形性膠質母細胞瘤的最新進展

白玥 鐘曉松 李文斌

·專家論壇·

嵌合抗原受體T細胞治療多形性膠質母細胞瘤的最新進展

白玥①鐘曉松②李文斌①

多形性膠質母細胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）是惡性程度最高的腦膠質瘤，傳統手術結合放、化療療效有限。嵌合抗原受體是由單一分子組成的抗原重組受體，重新定向T細胞的特異性和功能，由CD28或4-1BB構成的第二代CAR-T能識別抗原，完全活化T細胞并增強T細胞功能和持久性，是新興GBM療法的關注焦點。本文從CAR-T研究現狀出發，主要介紹其發展歷程和GBM相關的有效靶點，綜述其理論基礎，著重以白介素13受體α2、表皮生長因子受體變異Ⅶ、人表皮生長因子受體2和酪氨酸蛋白激酶受體A2這四種膠質瘤相關抗原為例，探討靶點的結構、功能特性、前期研究和臨床研究前景。選擇性表達在GBM的白介素13受體α2在臨床Ⅰ期治療復發性GBM是安全有效的；表皮生長因子受體變異Ⅷ只存在于癌細胞和膠質母細胞瘤干細胞，與預后不良密切相關，正在進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗；表皮生長因子受體2和酪氨酸蛋白激酶受體A也取得重大進展。這些特異性CAR-T可能成為治療相應靶向陽性的GBM的重要免疫療法。本文集中總結了目前CAR-T治療GBM的應用價值及挑戰。

多形性膠質母細胞瘤 嵌合抗原受體T細胞 白介素13受體α2 表皮生長因子受體變異Ⅷ 人表皮生長因子受體2 酪氨酸蛋白激酶受體A2

腦膠質瘤是人類最常見的原發性顱內惡性腫瘤，WHOⅣ級腦膠質瘤也稱為多形性膠質母細胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM），占惡性膠質瘤的80%以上，患者的中位總生存期僅為12～15個月，已成為致死率最高的癌癥之一［1］。傳統治療方案是手術切除結合輔助性替莫唑胺化療及同步放療，而針對多發性和生長位置不宜實施手術治療的惡性膠質瘤的治療措施有限。這種非特異性的治療方案不能使惡性膠質瘤完全緩解，并會對健康腦組織造成傷害，無益于提高患者的生存質量。此外，單個膠質瘤細胞可通過白質束、胼胝體或腦脊液轉移，導致復發，半數以上的患者在對側腦半球發現轉移灶。鑒于傳統治療效果欠佳，用嵌合抗原受體T細胞（chimeric anti?gen receptor T-cells，CAR-T）治療GBM，成為了全球免疫學家和臨床醫生共同奮斗的目標。

T細胞可通過基因工程合成表達針對特定腫瘤表面抗原的T細胞受體，叫嵌合抗原T細胞受體（chi?meric omtigen receptor，CAR）。CAR是將腫瘤特異性抗體單鏈片段（ScFv）結合至T細胞胞內信號傳導結構域（通常為TCR/CD3復合物的ζ鏈）形成的，常見的CAR還結合CD28或4-1BB共刺激結構域以促進細胞生存和增殖［2］。CAR-T療法是結合細胞療法、基因療法和現代免疫療法的高新技術，運用轉基因技術，現代T細胞分離培養技術和腫瘤生物學原理，分離和大量培養活化狀態的T細胞，特異性識別和殺傷腫瘤細胞［3-4］。從20世紀90年代T細胞工程作為免疫療法開始建立以來，CAR-T已在臨床試驗中取得了重大突破［5］，被公認為最有效治療癌癥方法。尤其是第二代（CD28或者4-1BB）為主的CAR-T細胞治療晚期急（慢）性淋巴細胞白血病及淋巴瘤，據統計［2］，其完全緩解率是70%～100%。CAR-T細胞治療黑色素瘤、淋巴瘤、成神經細胞瘤和結直腸癌等不同組織來源的惡性腫瘤同樣有效［6］。CAR-T細胞可以靶向任一抗原，甚至靶向腫瘤干細胞。基于ScFv與抗原緊密結合不存在HLA限制性的原理，此療法可克服HLA下調等免疫逃逸現象，能夠有效地發揮抗腫瘤作用，給復發、耐藥的癌癥治療帶來了新的曙光。

1 CAR-T細胞應用于GBM的基礎和挑戰

CAR-T細胞應用于GBM臨床治療仍面臨著巨大的挑戰。首先，為保證CAR-T細胞生存和增殖，并且發揮抗腫瘤效應，需在CAR的胞內信號傳導結構域以不同方式連接多種不同的共刺激結構域，增強細胞因子表達，活化效應T細胞。另外，CAR-T細胞需要遷移并滲入實體腫瘤病灶內部識別靶點。曾有報道認為可使修飾后的CAR-T細胞表達趨化因子受體，對腫瘤相關的趨化因子環境做出應答，幫助T細胞向病灶游走［7］。同時，尋找特異性腫瘤相關抗原或者腫瘤相關抗原，使CAR-T細胞精確地在實體腫瘤內部發揮作用，避免脫靶效應（off-target）。例如，靶向某些腫瘤細胞高表達的生長因子受體，阻斷該受體信號，誘導腫瘤細胞的凋亡［8］。也有研究表明［6］，在嵌合抗原受體的ζ鏈連接鋸鱗血抑肽（echistatin）序列后構建的eCAR，可與實體腫瘤新生血管內皮細胞高表達的整合素αvβ3特異性結合，有效減小黑色素瘤的體積。除了腫瘤特異性抗原，引進自殺基因也是避免脫靶效應對正常組織造成破壞的策略之一。

CAR-T技術的發展經歷了幾個階段的研究：第一代CAR的結構類似于TCR［9］，CD3不變鏈的胞質部分包含保守的免疫受體絡氨酸（ITAMs），通過磷酸化傳遞信號。這一類人工抗原受體將腫瘤特異性抗體單鏈片段與TCRζ鏈融合在一起，創建功能性CAR［10］。CAR-T細胞結合抗原后，會產生活化T細胞的“第一信號”，導致ζ鏈的ITAM磷酸化，與胞質蛋白絡氨酸激酶（PTK）Zap-70結合從而啟動TCR早期信號，使T細胞增殖為CTL細胞。第一信號是T細胞活化發揮細胞毒作用所需要的最低限度，不能完成T細胞的其他功能。第一代CAR-T細胞停留在G-G1期，無法避免細胞活化后導致的凋亡或變成無能細胞，不能長期存在。轉基因鼠模型［11］研究結果發現，只有CD3ζ鏈的CAR-T細胞缺乏共刺激分子傳導的“第二信號”，不能在體內環境發揮出抗腫瘤效果。使用第一代CAR-T細胞治療卵巢癌是最早的臨床試驗之一［12］。

將共刺激信號傳遞結構域融合在CAR中，能輔助T細胞完成更多功能。應用最廣泛的共刺激結構域是CD28或4-1BB，可放大活化信號，使暴露在抗原刺激中的CAR-T細胞成功增殖［13］。CD28與靶細胞或抗原提呈細胞（APC）表面的CD80或CD86結合，產生T細胞早期活化的“第二信號”，以PI3K-Akt為主要信號傳導途徑，使IL-2、INF-γ等多種細胞因子表達上調［14］，對IL-2分泌尤為重要。IL-2可抵抗T細胞轉化為無能細胞，是維持T細胞功能的關鍵因素［15］。CD28共刺激信號還可通過上調細胞周期蛋白D的表達，促使細胞進入G1期和S期。4-1BB是TNF受體家族成員之一，4-1BB共刺激信號促進細胞因子分泌速度較慢［16-18］，但4-1BB信號能對記憶性CD8+T產生影響，保證T細胞在體內長期生存并保持其記憶功能［19-20］。在CD4+和CD8+T細胞中，TCR和CD28信號可通過ERK和JNK信號傳導通路誘導4-1BB，增加細胞因子的分泌量［21-23］。這可促使受體蛋白SLP76、CD3ε和CD3ξ亞基和酪氨酸激酶LCK磷酸化，招募PKCθ，增加Ca2+內流［24］。TNF受體相關因子也參與該信號傳導，TRAF1激活ERK信號通路，上調BCL-XL表達，并抑制促凋亡蛋白BIM、TRAF2活化p38絲裂原蛋白激酶（p38MAPK）并通過NF-κB信號通路誘導抗凋亡因子BCL-XL和BFL-1表達［25］。將上述能產生“第二信號”的分子活性域整合到嵌合抗原受體中，就產生了第二代CAR，它們在過繼細胞療法中，展現了更強的實力。第二代CAR-T治療血液腫瘤［26］，尤其是多發性耐藥性急性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤在Ⅰ期臨床試驗中已取得重大成果［27-28］，2013年《科學》雜志將這種免疫細胞療法評為首位重大突破［5］。

第三代CARs將CD28和4-1BB/OX40串聯起來與CD3ζ鏈連接，將早期活化信號與持續活化信號相結合，被應用于許多臨床試驗［17，29］，NCT02349724靶向CEA治療腸癌，NCT02311621靶向GD+治療神經母細胞瘤等。

2 CAR-T治療GBM的特異性靶抗原或腫瘤相關抗原

CAR-T成功治療實體瘤（包括GBM）報道還很少，目前優化CAR-T的主要目標之一是尋找腫瘤特異性腫瘤抗原或者腫瘤相關抗原，或者尋找同時攻擊多種腫瘤的多種抗原或者表面分子，這種抗原只在腫瘤細胞表達，而正常細胞不表達或檢測不出來。

大量體外的前期臨床結果已證明，IL13Rα2（in?terleukin-13 receptorα chain variant2，白介素13受體α2）、EGFRⅧ（epidermalgrowth factor receptor-Ⅷ，表皮生長因子受體變異Ⅷ）、ErbB2（epidermal growth factor receptor 2，表皮生長因子受體2）和EphA2（eph?rinA2 receptor，酪氨酸蛋白激酶受體A2）這4種腫瘤相關抗原有可能成為治療GBM的靶點，在臨床前動物模型中及部分臨床試驗中取得了較好的結果。

白介素13受體α2（IL13Rα2），是一種膜結合蛋白，與IL13Rα1密切相關。已經證明成人、小兒腦腫瘤及腦膜瘤IL13Rα2表達豐富，相反，在正常人腦組織幾乎檢測不到。它在GBM細胞表面的表達量是正常組織細胞的3萬倍，58%的患者基因表達上調［29］，流式細胞儀分析其在U373細胞系和3例GBM患者細胞的平均表達量高達73%［30］，是免疫治療GBM有效靶點。它在免疫應答和腫瘤微環境中發揮重要作用，可阻斷細胞凋亡途徑，造成免疫逃逸。靶向IL13Rα2的第一代、第二代CAR-T均表現出明顯的抗腫瘤效果［31-34］。表達IL13 E13Y突變蛋白的一代CAR-T細胞對IL13Rα2有較高的親和力，競爭結合中樞神經系統內表達的IL-13a1/IL4Ra。該報道中［31］3例復發的GBM手術后通過顱腔直接多次注入IL13（E13Y）-zetakine的CD8（+）CTL細胞，2例生存期超過14個月，且不良反應不明顯。然而，第一代CAR-T細胞在膠質瘤環境下生存時間限制在15 d以內。最近的研究成果表明［32］，融合共刺激結構CAR-T細胞生存期延長，可發揮出更強的抗膠質瘤活性。在體外實驗中［33］，表達E13K和/或E13Y的第二代CAR-T可殺傷IL13Rα2+的GBM細胞，而不會對正常組織細胞造成傷害。小鼠原位膠質瘤實驗證明［34］，融合CD28的第二代E13KCAR-T細胞可殺傷腫瘤細胞，延長實驗小鼠的生存期。Brown等［35］發現IL13-zetakine修飾的靶向性T細胞同時殺傷IL13Rα2+的膠質瘤細胞和IL13Rα2+的干細胞樣腫瘤細胞亞群，這或許對徹底根除IL13Rα2+的膠質瘤有很大的幫助。2014年，美國希望之城醫院啟動了第二代IL13Rα2特異性CAR-T細胞的一期臨床試驗，該試驗評估瘤/腔內注入基因修飾后的自體T細胞治療GBM的可行性和安全性［36］。

表皮生長因子受體（EGFR）與預后不良相關。在人原發惡性膠質瘤中，EGFR基因自發重排為表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（EGFRvⅢ），但尚未在正常成人組織中檢測到。EGFRvⅢ的特點是EGFRmRNA的外顯子缺失（2～7外顯子），這種缺失是通過選擇性剪接或重排實現的。不同于EGFR，它似乎不受EGF和TGF-α調控。EGFRvⅢ過度表達顯示出強烈的致瘤性，可誘導腫瘤發生、侵襲，并使腫瘤細胞對治療產生抗性［37］。EGFRvⅢ只在大約30%的GBM腫瘤細胞［38］及腫瘤干細胞表面表達。EGFRvⅢ特異性CAR-T的優勢是能特異性清除腫瘤細胞而不損傷正常組織［39］。在Laura等［37］的研究中，鼠EGFRvⅢ特異性抗體單鏈片段3C10人源化，構建出2173 EGFRvⅢ4-1BBζCAR-T細胞，在體內、體外實驗中均表現出對U87 EGFRvⅢ的殺傷作用，且不損害人類表皮細胞。Sampson等［39］構建的鼠源性CD28/4-1BBξCAR-T細胞檢測了該種CAR的自身免疫反應，實驗結果表明EGFRvⅢ特異性CAR-T存在劑量依賴性，并且在治療前需要進行宿主淋巴細胞清除以保證治療效果。令人鼓舞的是，當治愈后的小鼠遭遇EGFRvⅢ陰性的腫瘤細胞再刺激時，表現出了抗腫瘤作用，說明這種治療方案可能在宿主體內建立了對新腫瘤的抵抗機制，有效地避免因免疫逃逸和腫瘤抗原缺失導致的復發。目前，第二代、第三代的EGFRvⅢ特異性CAR-T細胞在動物模型中均可發揮很好抗腫瘤作用［39-41］，基于這些臨床前實驗結果，NCT02209376（139 scFv-CD28-4-1BB-CD3ζCAR-T治療膠質母細胞瘤的ⅠⅡ期臨床試驗）、NCT01454596（#2173scFv-4-1BB-CD3ζCAR-T治療膠質母細胞瘤的Ⅰ期臨床試驗）正在招募中［42-43］。

酪氨酸蛋白激酶受體（ErbB2）是ERBB2基因編碼，位于人類17號染色體長臂（17q12），也稱為CD340，原癌基因Neu或HER2，是人表皮生長因子受體家族成員。ErbB2在41%的原發性膠質母細胞瘤和細胞系中表達［44］，它的信號途徑抑制腫瘤細胞凋亡，并增加腫瘤細胞侵襲轉移［45］。研究顯示［46］，來自GBM患者的CD28ζCAR-T細胞能夠殺死ErbB2+的原發性GBM腫瘤細胞，包括ErbB2+CD133+的GBM干細胞，并在動物模型中抑制腫瘤的生長。近期Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中［47］，ErbB2特異性CD28ζCAR-T治療不同組織類型的肉瘤有效率可達40%，并沒有不可控制的不良反應發生，該結果顯示了ErbB2特異性CAR-T治療實體瘤的巨大潛力。但是，曾有案例報道［48］，在肺癌患者體內注入1 010個第三代ErbB2特異性CAR-T細胞可引起細胞因子風暴，導致患者死亡，推測可能的原因是CAR-T細胞靶向ErbB2弱陽性的肺表皮細胞造成。ErbB2特異性CAR-T細胞是否能應用于GBM患者的治療，安全性將是研究者考慮的首要因素。

Eph受體A2（EphA2）是人EPHA2基因編碼的蛋白。該基因屬于蛋白-酪氨酸激酶家族肝配蛋白受體亞家族。酪氨酸激酶受體在胚胎循環系統的形成中起著關鍵作用，并控制病理性血管生成。Eph受體酪氨酸激酶調節神經系統發育過程中的細胞的空間組成，促進腫瘤血管生成。EphA2在U373細胞系表達量達81%，GBM原代細胞表達量為67%～93%［30］。過度表達的EphA2與腫瘤血管生成和腫瘤侵襲轉移密切相關，導致GBM預后不良［49］。鑒于靶向IL13Rα2、EGFRVⅢ的治療可因其突變缺失而無效，而靶向HER2治療的安全性有待考證，EphA2特異性CAR-T是新的研究方向。實驗證明［50］，EphA2在5例多形性膠質母細胞瘤的患者樣本和細胞系中均有表達，以人類EphA2單克隆抗體4H5構建的第二代EphA2特異性CAR-T細胞在體外對膠質母細胞瘤細胞系有明顯的殺傷作用，并能同時分泌IL-2和INF-γ幫助活化T細胞。在原位小鼠模型中，完全緩解率約為40%。該實驗認為EphA2特異性CAR-T細胞能抑制EphA2+膠質瘤干細胞的生長，可輔助殺傷CD133-的腫瘤發生細胞，阻止復發。靶向EphA2+細胞治療GBM是安全可行的，免疫組織化學結果顯示正常腦組織并不表達EphA2，正常上皮細胞表達EphA2水平低，但CAR-T細胞優先攻擊分裂的腫瘤細胞而不攻擊靜止的正常上皮細胞［51］。采用EphA2特異性CAR-T療法十分有價值，但是它的有效性和安全性仍有待更多動物模型和臨床試驗的驗證。

根據不同靶向GBM的前期研究結果，到目前為止，在體外通過基因修飾患者的T淋巴細胞，特異性識別膠質瘤細胞表面上的抗原或過度表達的分子，從而殺死膠質瘤細胞的治療方法，已有多個登記的臨床試驗：（https：//clinicaltrials.gov/ct2/results？term=CAR-T+and+glioma&Search=Search）。在不久的將來，有可能發現更多的針對GBM的CAR-T的新靶點。隨著診療技術的進步，通過組學研究、分子影像等技術結合大數據分析，精確判斷分子生物病理學特征，對疾病狀態和過程進行個體化診斷，可實現精準防治的目的。

3 結語

以特異性細胞為主（CAR-T））的免疫療法可避免放化療對腫瘤患者的傷害，有望提高其生存質量乃至治愈一些晚期癌癥患者。CAR-T是免疫學基礎理論的完美應用，重組逆轉錄病毒載體將編碼CAR的DNA轉導至T細胞中，使其表達由胞外腫瘤特異性抗體單克隆片段、胞內信號傳導結構域和/或共刺激分子組成的嵌合性抗原受體，識別腫瘤細胞時不受MHC限制，是一種新的腫瘤治療策略。

盡管目前CAR-T治療GBM處于早期臨床試驗階段，其面臨的主要挑戰是找到特異性的靶點及如何避免脫靶效應，防止移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的發生，另外由于免疫細胞導致的副腫瘤性小腦變性及多發性硬化癥造成腦部損傷等其它CAR-T治療可能導致的不良反應都是我們將要面臨的實際問題。其次，高級別膠質瘤有明顯抗原異質性，這是免疫療法治療膠質瘤的障礙之一，篩選我國GBM患者的腫瘤特異性表面抗原或者過度表達的分子，構建功能強大的特異性CAR-T細胞或者其它特異性的細胞，是未來的研究方向。采用何種方式注入安全劑量的CAR-T細胞，使其能在膠質瘤病灶處達到有效的治療濃度，達到完全活化狀態，發揮抗腫瘤作用仍需探索。

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（2016-04-30收稿）

（2016-08-25修回）

（編輯：鄭莉 校對：楊紅欣）

Progress on gliob lastom am ultifo rm e treatment with chim erican tigen receptor T-cells

Yue BAI1,Xiaosong ZHONG2,Wenbin LI1

1DepartmentofGlioma,Beijing Shijitan Hospitalof the CapitalMedicalUniversity,Beijing 100038,China;2The Center ofGene and Cell Engineering,Beijing Shijitan Hospitalof the CapitalMedicalUniversity,Beijing 100038,China

Glioblastomamultiforme(GBM)is themostmalignant form of glioma,and its treatment through traditionalsurgery combined w ith chemotherapy and radiotherapy has lim ited efficacy.Chimeric antigen receptor T-cells(CAR-T)are recombinant receptors for antigen,which,in a singlemolecule,redirectandmediate antigen recognition,T-cellactivation,and,in the case of second-generation chimeric antigen receptors(CARs)costimulation(CD28 or 4-BB),augment T-cell functionality and persistence.CARsare the focus ofattention in emerging treatmentoptions for GBM.Thisarticlemainly introduces the developmentprocessof CAR-T therapy and the recent successofadoptive transfer of CAR-Tcells.Effective targetsof the treatmentofGBM w ith CAR-Taccording to this research are discussed aswell.Some of themost extensively studied targetson GBM,especially interleukin-13 receptorαchain variant 2,epidermalgrow th factor receptor-Ⅷ(EGFRⅧ),human epidermalgrow th factor receptor 2(ErbB2),and ephrinA2 receptor(ErbA2),and thedifferent characteristics of each kind of alloantigen-specific CAR-T cells,are the basis for CAR-T therapy and indicate their different characteristicsor utilitiesand the prospectof further clinical research.The discovery of selective expression of interleukin-13 receptor alpha 2 in glioma cellsmore than 20 yearsago prompted the clinical trialof CAR-T therapy in stage IGBM tumors,and the therapywas proven safe and effective.EGFRⅧisaneoantigen presenting only in cancer cellsand glioblastoma stem cells.Itspresence is correlated w ith poor prognosis,and a phaseⅠ/Ⅱ trial is ongoing at different institutes.ErbB2-specific CARswere also expressed in human T-cells.Adoptive transfer of EphA2(or ErbB2)-specific Tcells resulted in the regression ofglioma xenografts.Thus,target-specific CAR-T immunotherapymay be a prom ising approach for the treatment of different target-positive GBM.Finally,we summarize the application value and challenge ofCAR-Tcell therapy in the treatmentofGBM.

glioblastomamultiforme,chimeric antigen receptor T-cell,IL-13Rα2,EGFRⅧ,ErbB2,EphA2

Wenbin LI;E-mail：neure55@126.com

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.16.462

李文斌，醫學博士、主任醫師、教授。現任首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院腦膠質瘤科主任，兼任中國醫師協會腦膠質瘤專業委員會常委兼總干事，中國抗癌協會期刊出版部部長，神經腫瘤專業委員會常委，腫瘤藥物臨床研究專業委員會常委，CurrentSignal Transduction Therapy期刊編委及亞洲編輯部執行副主任，Cancer Biology&Medicine、《中國腫瘤臨床》期刊編委。1999年至2005年，于美國賓夕法利亞大學醫學院、美國南佛羅里達大學醫學院和美國莫菲特（國家）癌癥中心及研究所實驗治療科學習及研究。2013年“腦膠質瘤診療技術創新的基礎研究與臨床研究”榮獲教育部科學技術進步一等獎，并獲得“原發替莫唑胺及貝伐珠單抗賴藥的膠質母細胞瘤細胞系及其構建方法和應用”專利權。2009年任國家863課題“低消耗大規模集成微流控分子診斷芯片研發”課題組副組長；2012～2015年任國家863計劃“腦膠質瘤分子分型與生物標志物研究”子課題“識別中國人群腦膠質瘤關鍵癌癥通路和分子調控網絡”負責人。先后承擔了10余項科研課題，發表40余篇研究論文，主編或副主編10余種專著。

①首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院腦膠質瘤科（北京市100038）；②首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院臨床基因和細胞工程技術中心

李文斌 neure55@126.com

白玥 專業方向為腦膠質瘤基礎研究和臨床診治。

E-mail：18612946653@163.com