口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重組腺病毒質粒的構建

賈俊濤++郭鳳英++烏倫吉如嘎++張小宇++陳金頂

摘要：根據siRNA設計原則，分別選擇O型FMDV的L和2B基因上保守序列作為可能的干擾位點，設計了2個siRNAs，并將siRNAs克隆到pSIREN-Shuttle中，獲得2個siRNA重組表達載體pShuttle-L和pShuttle-2B。用限制性內切酶I-Ceu I和PI-Sce I雙酶切siRNA重組表達載體和腺病毒質粒載體pAdeno-X，利用體外連接法獲得了重組質粒。經PCR擴增、酶切鑒定及序列測定，成功構建了重組腺病毒質粒pAdeno-L和pAdeno-2B。

關鍵詞：口蹄疫病毒；RNA干擾；重組腺病毒質粒

中圖分類號：S852.65+9.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3152-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.039

Construction of Recombinant Adenovirus Plasmid Containing the L and 2B Gene siRNAs of Foot-and-Mouth Disease Virus

JIA Jun-tao1，GUO Feng-ying1，Wulunjiruga1，ZHANG Xiao-yu1，CHEN Jin-ding2

（1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricuitural University， Baotou 014109， Inner Mongolia， China；

2.South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China）

Abstract： In this study， the conservative sequence in L and 2B gene of O type FMDV were chose as possible interference sites. Two siRNAs were designed and synthesized. These siRNAs were cloned into the plasmid pSIREN-Shuttle， then the siRNAs recombined expression vectors were obtained including pShuttle-L and pShuttle-2B. The vectors and the adenovirus vector pAdeno-X were digested with restriction endonuclease I-Ceu I and PI-Sce I and connected in vitro， then recombinant plasmids were obtained. The result of PCR， enzyme-cutting and sequencing suggested that the recombined adenovirus plasmids pAdeno-L and pAdeno-2B were constructed successfully.

Key words： Foot-and-mouth disease virus（FMDV）； RNA interference（RNAi）； recombinant adenovirus plasmid

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。它不僅可使動物生產性能下降，而且還限制動物及動物產品的國際貿易，有“政治經濟病”之稱，被OIE列為烈性傳染病之首[2]。由于FMDV感染率高、傳染性強、患病動物排毒量大，可使爆發地區遭受巨大經濟損失，因此該病是世界各國檢疫和防疫的重點對象。目前，采用免疫接種與撲殺相結合，再輔以封殺、隔離、消毒、抗體檢測等綜合措施，但仍不能控制FMDV的感染與傳播，這就迫使人們尋求更加有效的防控方法。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一項可以在體外有效抑制病毒復制的技術，其是由與靶基因序列同源的dsRNA引發廣泛存在于動植物中的序列特異性基因轉錄后的沉默過程[3]。腺病毒載體因具有感染細胞種類多、感染效率高、外源基因表達水平高，且既適于體外又適于體內研究等特點而被作為轉基因載體[4]。本研究構建了攜帶有O型FMDV L、2B基因siRNA片段的重組腺病毒質粒，為研究腺病毒介導的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質粒和菌株 FMDV O/HKN/2003由華南農業大學獸醫學院微生物實驗室保存。E1、E3區缺失的腺病毒質粒載體pAdeno-X、穿梭質粒pSIREN-shuttle由廣州醫學院李彬教授惠贈。大腸桿菌DH5α購自廣州合達生物技術公司。

1.1.2 主要試劑 歸位內切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ購自NEB公司。去內毒素質粒小量抽提試劑盒為OMEGA公司產品；DNA轉染試劑Lipofectamine2000為Invitrogen產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據腺病毒質粒pAdeno-X序列和歸位內切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ的識別序列，設計下列引物：P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′；P2：5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′，引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成。endprint

1.2.2 siRNA表達質粒的獲得 根據siRNA的設計原則[5]，以GenBank中O型FMDV基因組核苷酸序列以及現有的FMDV株O/HKN/2003的序列測定結果，選擇非結構蛋白L、2B基因保守序列作為可能的干擾位點，設計了含有siRNA序列的寡核苷酸片段，命名為siRNA-L、siRNA-2B。將siRNA寡核苷酸片段克隆到pSIREN-Shuttle中，經過鑒定獲得陽性克隆。

1.2.3 重組腺病毒穿梭質粒載體的獲得 提取鑒定正確的重組質粒及腺病毒質粒載體pAdeno-X分別進行I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ雙酶切，回收酶切產物，連接回收產物，轉化大腸桿菌DH5α。以P1、P2為引物進行菌落PCR，篩選陽性克隆。PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。同時采用質粒PCR、Pac Ⅰ酶切及測序鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌落PCR鑒定

在轉化的平板上各選取5個菌落進行菌落PCR來初步篩選陽性克隆，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，分別有4個菌落擴增出大小為600 bp左右的電泳條帶，其大小與預期相符（圖1、圖2）。

2.2 重組腺病毒質粒載體PCR鑒定

菌落PCR篩選后，以質粒為模板，進行質粒PCR鑒定，擴增出大小約600 bp的電泳條帶，其大小與預期相符（圖3），進一步證實陽性重組子的可能性。

2.3 重組腺病毒質粒載體的酶切鑒定

將可能的陽性重組子用Pac Ⅰ酶切后出現兩條亮帶，一條在3 000 bp左右，另一條在30 kb左右，與預期相符（圖4）。結果表明，重組質粒構建成功。

2.4 重組質粒載體的序列測定

將質粒PCR鑒定為陽性的重組質粒載體pAdeno-L、pAdeno-2B進行序列測定，結果與預期序列完全吻合（圖5、圖6）。

3 小結與討論

口蹄疫是目前危害世界養殖業的重要疾病之一。FMDV滅活疫苗防治是目前防治該病的重要手段之一，但這種預防措施只能給動物提供短期保護，而且存在病毒逃逸和病毒滅活不徹底的潛在危險。迅速發展的RNAi技術已經使其成為一種功能強大的研究動物特定基因表達和功能的工具[3]。已有報道表明，通過人工轉染siRNA能夠有效地誘發RNAi抵抗病毒的感染[6]。由于RNAi技術的快速性和特異性，可以彌補目前已有的病毒防御手段的不足。口蹄疫病毒的基因組是一條單鏈RNA，其既作為信使RNA又作為復制模板行使功能，因此口蹄疫是利用RNA干擾技術防制的理想對象。

本研究選擇了FMDV L、2B基因保守序列作為可能的干擾位點，并設計了含有相應siRNA序列的寡核苷酸片段。FMDV基因組為單股正鏈RNA，其基因組RNA具有mRNA性質。L、2B基因屬于FMDV的非結構蛋白基因。在FMDV的復制過程中，Lpro可特異性地降解宿主翻譯起始因子eIF-4G，導致宿主依賴cap的mRNA翻譯關閉[7，8]。Lpro對宿主蛋白質合成具有抑制作用，因此認為是FMDV的毒力因子。2B基因編碼的2B蛋白具有輔助病毒誘導細胞病變作用，現已表明2B蛋白能增強膜的通透性和阻斷蛋白分泌途徑。FMDV的L和2B基因在病毒復制周期中發揮重要作用，因此，如果L、2B基因的表達被抑制，就會抑制病毒的增殖。

RNAi表達載體有質粒載體[9]和病毒載體[10，11]，其中病毒載體克服了質粒轉染細胞效率低的缺點，并可體內應用，實現長時間的靶基因沉默，具有臨床應用前景等優勢。腺病毒是目前轉基因效率最高的載體之一，被廣泛用于基因治療、基因功能性研究等領域。目前用于基因治療的腺病毒載體多為復制缺陷型載體，即缺失了腺病毒基因組中某些復制增殖所必需的基因，這部分基因的功能由輔助細胞或病毒提供。本研究采用復制缺陷型腺病毒載體，使用體外連接的方法成功構建了重組腺病毒質粒pAdeno-L和pAdeno-2B，為研究腺病毒介導的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基礎。

參考文獻：

[1] BROWN F. The history of research in foot-and-mouth disease virus[J].Virus Research，2003，91：3-7.

[2] SOBRINO F，S IZ M，JIM NEZ-CLAVERO M A，at al. Foot-and-mouth disease virus：A long known virus，but a current threat[J].Vet Res，2001，32（1）：1-30.

[3] FAMULOK M，VERMA S. In vivo-applied funcationl RNAs as tools in proteomics and genomics research[J].Trends Biotechnol，2002，20：462-466.

[4] MCCONNELL M J，IMPERIALE M J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy[J].Hum Gene Ther，2004，15：1022-1033.

[5] TUSHL T. Expanding small RNA interference[J].Nat Biotechnol，2002，20（5）：446-468.

[6] DING S W. RNA silencing：A conserved antiviral immunity of plants and animals[J].Virus Res，2004，102：109-115.

[7] DEVNAYE M A，VAKHARIA V N，LLOYD R E，et al. Leader portein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex[J].J Virol，1988，62：4407-4409.

[8] MEDINA M，DOMINGO E，BRNAGYN J K，et al. The two species of the foot-and-mouth disease viurs leader protein，expressed individually，exhibit the same activities[J].J Virol，1993， 194：355-359.

[9] BRUMMELKAMP T R，BERNARDS R，AGAMI R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science，2002，296：550-553.

[10] SCHOMBER T，KALBERER P C，WODNAR-FILIPOWICZ A，et al. Gene silencing by lentivirus-mediated delivery of siRNA in human CD34+ cells[J].Blood，2004，103（12）：4511-4513.

[11] UPRICHARD S L，BOYD B，ALTHAGE A，et al. Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（3）：773-778.endprint