正交試驗法優化甲醇提取艾蒿中槲皮素工藝條件

沙芮++陳靜++丁潔++牛犇++宋勇強++梁寧

摘要：以艾蒿為原料，槲皮素含量為指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計法優化甲醇提取艾蒿中槲皮素的工藝。結果表明，甲醇提取艾蒿中槲皮素最佳提取工藝為料液比1∶16（g/mL），甲醇體積分數100%，浸泡時間2 h，超聲時間30 min。按優選工藝條件下槲皮素含量為0.698 mg/g，驗證試驗證明結果穩定，具有生產應用價值。

關鍵詞：正交試驗；艾蒿；槲皮素；甲醇

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3133-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.034

Study on Orthogonal Test Optimization of Methanol Extraction of Quercetin from Artemisia argyi Process Conditions

SHA Rui，CHEN Jin，DING Jie，NIU Ben，SONG Yong-qiang，Liang Ning

（Commercial Technology Institute of Gansu Province，Lanzhou 730020， China）

Abstract： Artemisiaargyi was treated the raw material with methanolto extract quercetinand the yield of quercetinwas used to be an indicator. On the basis of single-factor experiments，the orthogonal experiment method were carried out to optimize the extraction process ofquercetin. The results showed that the optimal extraction parameters were found as follows：mass fraction of methanol 100%；material-to-liquid 1∶16 g/mL；soak time 4 h；ultraphonic time 30 min. According to the optimal process conditions the yield ofquercetin was 0.698%.It could be well fitted with model and was reliable and applicable for actual prediction.It had value of production.

Key words： the orthogonal experiment method； Artemisia argyi； quercetin； methanol

艾蒿（Artemisia argyi Levt. et Vant）為菊科（Compositae）艾屬（Artemisia）多年生草本植物，主要分布于亞洲東部，如朝鮮半島、日本、蒙古，中國東北、華北、華東、華南、西南、陜西及甘肅等地均有分布。其適應性強，普遍生長于路旁荒野、草地[1]。尤其以西北寒旱地區生長的有效成分高，品質優良藥用價值高[2]。據文獻報道[3-7]，艾蒿中的化學成分主要有黃酮、三萜、揮發油類，黃酮中含有槲皮素和柚皮素成分，槲皮素除有抗菌、消炎、抗癌、抗氧化、心血管系統保護作用外[8]，槲皮素聯合放射線有顯著減少瘢痕疙瘩成纖維細胞的膠原合成作用，槲皮素對皮膚具有保護作用。但目前對艾蒿中槲皮素定量的分析研究鮮見。槲皮素含量測定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法等。雖然高效液相色譜法檢測限低、靈敏度高，但該方法檢測設備成本高、耗時、操作步驟繁雜。而紫外分光光度法具有操作簡便、成本低等特點。本研究采用紫外分光光度法艾蒿中槲皮素進行含量測定，為艾蒿黃酮類化合物定量分析提供一種簡便、有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 艾葉產地河北，購自蘭州黃河藥材市場，經蘭州大學藥學院生藥室馬志剛教授鑒定；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號164782）；槲皮素標準品（ChromaDex，美國，批號00017030-566）；純水（自制，pH 6.82，電導率15 μs/cm（27 ℃））。

1.1.2 儀器 UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS225A型電子分析天平（普利塞斯公司，瑞士）；優普UPT-I-20L落地式純水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 槲皮素標準品溶液制備[9] 精密稱量槲皮素標準品5.13 mg，用5 mL甲醇溶液溶解，定容于5 mL容量瓶，得到濃度為1.026 0 mg/mL槲皮素標準品溶液。分別取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL定容于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液定容至10 mL，配置成標準溶液。在300～600 nm范圍內掃描，槲皮素標準品溶液在370 nm處有最大吸收峰，和陳志剛等[10]測定的槲皮素最大吸收波長374 nm基本相同，以吸光度對質量濃度做標準曲線。槲皮素標準品在此質量濃度范圍內與吸光度成良好線性關系。線性回歸方程為y=7.617x-0.014，R2=0.991。槲皮素在0.015 5～0.094 4 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系。endprint

1.2.2 槲皮素提取 稱取5 g艾蒿，剪碎，放入250 mL三角瓶中，加入一定質量甲醇，浸泡，超聲，過濾，計算艾蒿中槲皮素得率。

1.2.3 艾蒿提取槲皮素單因素試驗[11] 固定艾蒿甲醇料液比（g/mL，下同）1∶12，甲醇體積分數80%、浸泡2 h、設定超聲波功率100 W提取時間15 min的情況下，改變其中1個因素，料液比1∶12、1∶16、1∶20、 1∶24、1∶28；甲醇濃度60%、70%、80%、90%、100%；浸泡時間1、2、3、4、5、6 h；超聲提取5、15、25、35、45 min，進行單因素試驗，以得率為指標，擇優參數。

1.2.4 正交試驗設計 采用SPSS19.0軟件，在單因素試驗基礎上，依據單因素試驗結果設置水平，以料液比、甲醇體積分數、浸泡時間、超聲時間4個因素的3個水平設計正交試驗L9（34）優化艾蒿甲醇提取槲皮素工藝（表1）。

1.2.5 數據處理 采用SPSS19.0統計軟件對試驗數據進行分析，結果以平均值±標準誤差（M±SE）表示，對各組結果采用統計學Duncan檢驗比較差異，以不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 料液比對槲皮素含量的影響 由圖1可知，隨著溶劑的增加槲皮素得率增加，差異顯著。試驗對比顯示，料液比>1∶6時，甲醇剛剛浸沒艾蒿，甲醇量過少對槲皮素的含量有影響。當料液比從1∶12降至1∶16，槲皮素得率大幅提高，說明甲醇量增加可以更好地析出槲皮素。當甲醇量繼續增加，槲皮素得率變化不大，料液比低于1∶20后得率基本不變，說明溶劑量增大到一定程度，析出速率達到平衡。因此選擇1∶12～1∶20為料液比的正交試驗因素水平。

2.1.2 甲醇濃度對槲皮素得率的影響 由圖2可知，隨著甲醇體積分數提高槲皮素得率增加，差異顯著。試驗對比顯示，甲醇體積分數﹤80%時，水中易浸出其他易溶于水的黃酮類物質，可能對槲皮素這種易溶于醇的極性較小苷元的浸出有影響。當甲醇體積分數>80%后，槲皮素得率基本不變，說明甲醇體積分數越大水的影響因素越小，溶解速率達到平衡。因此選擇80%～100%為甲醇體積分數的正交試驗因素水平。

2.1.3 浸泡時間對槲皮素得率影響 由圖3可知，槲皮素得率隨著浸泡時間的增加呈上升趨勢，浸泡時間<3 h時，差異顯著。浸泡超過3 h后提取率基本不變。由此可知通過浸泡有利于槲皮素浸出，但浸泡時間使槲皮素浸出能力有限，浸泡時間>3 h時，通過浸泡的溶解物質達到飽和，不再浸出。綜合試驗效率因素，選擇時間2～6 h為浸泡時間的正交試驗因素水平。

2.1.4 超聲時間對槲皮素得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時間延長，槲皮素得率呈上升趨勢，在15～35 min內槲皮素得率增加較快，且差異顯著，超過35 min槲皮素得率基本不變，說明35 min左右槲皮素浸出達到平衡。隨著超聲時間加長，溫度增高，槲皮素苷元浸出達到平衡，所以槲皮素得率基本不變。因此選擇15～45 min為超聲時間的正交試驗因素水平。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇4個影響因素的3個水平設計正交實驗L9（34）優化艾蒿槲皮素甲醇提取工藝（表1）。

由表2、表3可知，艾蒿槲皮素甲醇提取的影響因素中，甲醇體積分數影響極顯著，料液比、超聲時間影響不顯著。由表2可知，最佳提取條件為A2B3C1D2；而極差分析結果中得出的最佳工藝方案是A2B3C2D3，二者不一致，通過驗證試驗比較，即料液比1∶16，甲醇體積分數100%，浸泡時間4 h，超聲時間45 min條件下進行提取，計算槲皮素含量，重復6次，含量為0.665%，RSD=1.86%（n=6）。由此可知，在極差分析結果中得出的最佳提取條件和表2中得出的最佳提取條件提取率差異不大，綜合成本因素，得出最佳提取條件為A2B3C1D2，即料液比1∶16，甲醇體積分數100%，浸泡時間2 h，超聲時間30 min。

3 小結與討論

1）槲皮素作為一種多羥基黃酮類化合物[12-18]具有多種生物學活性及很高的藥用價值，槲皮素除了抗氧化清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒之外，近年來研究還發現槲皮素對心血管系統有保護作用，抗抑郁作用，而且槲皮素聯合放射線顯著減少體外培養瘢痕疙瘩治療藥物，與放療聯合作用，可減少放療劑量，減輕放療對正常皮膚的損害。而且槲皮素廣泛存在于植物的花、果實中，目前已知有100多種中草藥中含有槲皮素。而且艾蒿分布廣泛，成活率高，成本低，可作為理想提取槲皮素植物。

2）槲皮素提取一般選用乙醇，甲醇或混合提取[19]，根據之前的提取研究，高體積分數的甲醇比乙醇對槲皮素的提取率高，所以本次試驗選用甲醇作為提取溶劑。

3）超聲提取利用超聲波破壞植物細胞和細胞膜結構[20]，增加細胞內容物穿透力，有助于黃酮類化合物釋放與溶出，同時超聲波的熱效應使得水溫基本在57 ℃左右，對原料也有水浴作用。對比回流提取，具有省時、高效、節能、提高原料利用率的優點。

綜上所述，通過單因素和正交試驗，確定艾蒿中甲醇提取槲皮素最佳工藝參數為料液比1∶16，甲醇質量分數100%，浸泡時間2 h，超聲時間30 min。槲皮素含量達0.698 mg/g。艾蒿分布廣泛、成活率高、成本低，可作為理想提取槲皮素植物，為槲皮素的綜合利用提供參考。

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