近紅外光譜法預(yù)測(cè)紫花苜蓿草捆的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和消化率

薛祝林，劉 楠，張英俊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所，北京100193）

隨著我國(guó)規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化奶牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，對(duì)高品質(zhì)飼草料的需求量將越來(lái)越大，且牧草品質(zhì)的優(yōu)劣與畜產(chǎn)品質(zhì)量的好壞密切相關(guān)。苜蓿（Medicagosativa）、燕 麥（Avena.sativa）、羊 草（Leymuschinensis）、黑麥草（Loliumspp.）等優(yōu)良牧草品質(zhì)的優(yōu)劣和消化率的高低能夠很大程度上影響到畜牧業(yè)的發(fā)展，如草產(chǎn)品的生產(chǎn)、流通及動(dòng)物生產(chǎn)性能等。苜蓿作為世界上廣泛種植的牧草［1］，推廣、利用及評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與飼用價(jià)值就顯得尤為重要［2］。

由于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)牧草化學(xué)成分需要周期較長(zhǎng)、耗費(fèi)勞動(dòng)力且成本高，尤其在大批量樣品測(cè)定和育種材料篩選時(shí)受到一定的限制［3］。近紅外反射光譜技術(shù)（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）以其分析速度快，不需要化學(xué)試劑，減少環(huán)境污染，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，成本低，易于在線分析等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用［4］。NIRS在國(guó)內(nèi)外廣泛用于農(nóng)牧產(chǎn)品和食品中的蛋白質(zhì)、水分、脂肪、淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分的快速檢測(cè)［5］，草地植被氮素含量估測(cè)［6］，粗飼料品質(zhì)檢測(cè)及分級(jí)指數(shù)的在線分析等［7］。以往的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值參數(shù)研究主要集中于局部地區(qū)采集樣品，建立定標(biāo)模型，且預(yù)測(cè)指標(biāo)主要為常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，纖維素、能量和消化率方面鮮有報(bào)道。本研究的意義在于尋求和建立適合中國(guó)苜蓿主產(chǎn)區(qū)干草草捆的近紅外預(yù)測(cè)模型，探討利用NIRS預(yù)測(cè)苜蓿草捆營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、能量和消化率等方面的可行性，建立快速、高效的近紅外預(yù)測(cè)模型，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 取樣設(shè)備

使用C60美國(guó)貝斯特取樣器，一個(gè)鋒利的，長(zhǎng)度90cm，直徑約為1.90cm中空金屬裝置，取樣器手柄底端附帶可充電池。

1.2 材料來(lái)源

分別于黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山東等苜蓿主產(chǎn)區(qū)共6省份23個(gè)采樣點(diǎn)，采集不同品種、茬次、生育期、管理水平的苜蓿干草草捆樣品，共采集14個(gè)苜蓿品種229份干草樣品。

1.3 苜蓿干草草捆取樣方法

取樣原則：取樣時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照取樣計(jì)劃，遵循取樣操作規(guī)程及取樣的代表性和隨機(jī)性原則，多點(diǎn)取樣。取樣器頂端的切割面與取樣器的軸成90度，于草捆兩端扎口線之間取樣，避開草捆邊緣15cm以上，垂直鉆入草捆中40cm深度鉆取樣品，選取20捆以上，每捆一芯，采20芯代表一批干草；對(duì)于大批次的干草（100～200t）或者具有高差異性的干草，抽取35芯［8］。取樣結(jié)束后將混合的20個(gè)取芯樣品，放在密閉性能良好的聚乙烯塑料袋中，在低溫、避光、隔熱條件下保存。

1.4 化學(xué)成分測(cè)定方法

粗蛋白（CP）采用凱氏定氮法GB/T6432-94；粗脂肪（EE）采用索氏抽提法 GB/T 6433-94；粗灰分（Ash）按照GB/T6438-92方法；中性洗滌纖維（NDF）參照GB/T20806-2006方法；酸性洗滌纖維（ADF）按照NY/T1459-2007；酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）按 GB/T20805-2006；鈣（Ca）采用高錳酸鉀滴定 法（GB/T6436-2002）；磷（P）采用分光光度法（GB/T6437-2002）。每個(gè)試樣取兩個(gè)平行樣測(cè)定，取平均值。根據(jù)苜蓿干草捆樣品的CP，ADF，NDF值，計(jì)算各樣品的代謝能（Metabolizable Energy，ME），DMI［9］，DDM，RFV［10］值。各值預(yù)測(cè)模型如下：

1.5 消化率的測(cè)定

選用5頭日糧一致且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，作為瘤胃液供體動(dòng)物。瘤胃液于晨飼前1h內(nèi)采集，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后等體積混勻，置于39℃恒溫水浴鍋中備用。方法參照龐德公等［11］，使用移液器向各瓶中加入50mL pH 6.85的緩沖液［12］，預(yù)熱至39℃，之后向發(fā)酵瓶中接入瘤胃液25 mL，通入氮?dú)?～5s以驅(qū)除空氣后，立即蓋上膠塞并旋緊瓶蓋進(jìn)行發(fā)酵，所有發(fā)酵瓶在恒溫生化培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h后，使用200目尼龍袋收集殘?jiān)瑴y(cè)定苜蓿DM 消化率（IVDMD）、NDF消化率（NDFD）、ADF消化率（ADFD）。

1.6 近紅外預(yù)測(cè)模型的建立

1.6.1 主要儀器與軟件 使用FOSS公司的NIR System5000近紅外光譜分析儀。工作參數(shù)：波長(zhǎng)范圍，1100～2500nm；波長(zhǎng)間隔2nm，每個(gè)樣品重復(fù)裝樣及掃樣3次，取平均值，并轉(zhuǎn)化為log1/R形式記錄光譜數(shù)據(jù)。定標(biāo)軟件為WinISIⅢ；工作條件：室溫25℃穩(wěn)定。

1.6.2 模型的建立與驗(yàn)證 將樣品均按3∶1隨機(jī)分為定標(biāo)集和驗(yàn)證集［13］。使用 WinISIⅢ軟件，采用改進(jìn)的偏最小二乘法（MPLS），結(jié)合散射處理、導(dǎo)數(shù)、平滑等不同的光譜預(yù)處理和數(shù)學(xué)處理方法，用定標(biāo)集樣品建立模型。建模時(shí)用全局距離（GH）、“X”和“T”檢驗(yàn)對(duì)光譜異常值進(jìn)行剔除；當(dāng)GH≥10，X≥10和T＞2.5時(shí)，則被認(rèn)為是光譜值超常樣品，剔除。模型內(nèi)部采用交叉驗(yàn)證，防止過(guò)擬合現(xiàn)象。根據(jù)定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SEC）、交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（1-VR）、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）等指標(biāo)評(píng)價(jià)，確定最優(yōu)模型［14］。驗(yàn)證集樣品對(duì)最優(yōu)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其外部預(yù)測(cè)能力［15］。最后，用交叉驗(yàn)證相對(duì)分析誤差RPDCV和外部驗(yàn)證相對(duì)分析誤差RPDP對(duì)模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)［16］：RPDCV 和 RPDP大于3，說(shuō)明定標(biāo)效果良好，建立的模型可以用于實(shí)際檢測(cè)；2.5≤RPD＜3，表示模型滿足以篩選牧草品質(zhì)為目的粗略分析；RPD＜2.5，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)精度有待進(jìn)一步提高。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分化學(xué)分析結(jié)果

苜蓿定標(biāo)集、驗(yàn)證集的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果如表1所示。以絕干物質(zhì)為基礎(chǔ)，定標(biāo)集苜蓿的CP，NDF，ADF，DM，Ash，EE，Ca，P含量的大小范圍分別為13.72%～22.23%，29.05%～61.89%，23.06%～50.37%，90.77%～93.91%，6.95%～17.80%，0.63%～2.67%，0.74%～3.10及0.10%～0.28%，平均含量分別為17.41%，47.68%，39.15%，92.16%，10.72%，1.46%，1.66%，0.20%。標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.20%，6.85%，5.42%，0.57%，2.07%，0.41%，0.46%，0.048%，其 中NDF的標(biāo)準(zhǔn)差最大，達(dá)到6.85%，ADF標(biāo)準(zhǔn)差次之為5.42%，其次為CP標(biāo)準(zhǔn)差（2.20%），這說(shuō)明牧草樣品的NDF，ADF，CP在很大程度上受物候期，品種和管理水平的影響。驗(yàn)證集所有樣品的CP，NDF，ADF，Ash，EE，Ca，P含量的大小范圍均介于定標(biāo)集之間。

表1 定標(biāo)集和驗(yàn)證集樣品成分化學(xué)分析結(jié)果Table 1 Chemical analyzing results of calibration and validation samples

由表2可知，ME含量的標(biāo)準(zhǔn)差最小，定標(biāo)集和驗(yàn)證集分別僅為0.32%和0.40%。RFV的偏差最大，定標(biāo)集和驗(yàn)證集分別可達(dá)28.25%和27.65%，定標(biāo)集和驗(yàn)證集的大小范圍分別為79.37%～227.11%和83.91%～210.38%，校正集和驗(yàn)證集中最小值、平均值、最大值和標(biāo)準(zhǔn)差都比較接近，樣品間變異幅度較大，很大程度上可以覆蓋可能出現(xiàn)的RFV變化范圍，樣品具有較強(qiáng)的代表性。

表2 纖維素、消化率和能量分析數(shù)據(jù)Table 2 Chemical analyzing results of cellulose，digestibility and ME

2.2 紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分模型的建立與評(píng)價(jià)

不同化學(xué)成分相關(guān)的含氫官能團(tuán)類型或含量不同，光譜吸收就會(huì)有差異，建模的光譜處理方法和參數(shù)設(shè)置也就不同［17］。本試驗(yàn)利用 WinISIⅢ定標(biāo)軟件，采用改進(jìn)的MPLS，結(jié)合不同光譜處理和數(shù)學(xué)參數(shù)設(shè)置，對(duì)定標(biāo)集樣品建模，觀察統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)列SECV和1-VR值的高低，找出SECV值最低，1-VR值最高的模型，即為篩選出的最佳模型，建立的模型效果衡量指標(biāo)采用RPDCV。由表3結(jié)果可知，RFV，NDF的RPDCV值最高分別為4.54和4.34，CP和ADF的RPDCV值均高于3，說(shuō)明RFV，NDF，ADF和CP的模型能用于實(shí)際含量的分析。此外，Hemicellulose和IVDMD的RPDCV值介于2.5～3之間，說(shuō)明兩者的模型能夠用于粗略分析，需要對(duì)定標(biāo)集樣品進(jìn)一步擴(kuò)充和完善以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度。反之，其他指標(biāo)的RPDCV值均低于2.5，預(yù)測(cè)效果較差。

表3 化學(xué)成分模型參數(shù)Table 3 Results of spectrum treatment parameters by MPLS models

2.3 模型的外部驗(yàn)證

校正模型建立后，采用外部驗(yàn)證的方法用驗(yàn)證集樣品對(duì)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)RSQ，SEP，RPDP評(píng)價(jià)模型實(shí)際預(yù)測(cè)效果，進(jìn)一步檢驗(yàn)其優(yōu)劣。外部驗(yàn)證結(jié)果表明，預(yù)測(cè)值與牧草RFV化學(xué)值的預(yù)測(cè)決定系數(shù)最高達(dá)0.935，其次是NDF預(yù)測(cè)決定系數(shù)為0.932，CP為0.918，此外ADF，Hemicellulose，IVDMD的預(yù)測(cè)決定系數(shù)范圍介于0.79～0.87之間；RPDP值與預(yù)測(cè)決定系數(shù)呈相似趨勢(shì)，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較高，可用近紅外光譜技術(shù)預(yù)測(cè)苜蓿中RFV，NDF，ADF和CP的含量。NDFD和ADFD的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)最低，預(yù)測(cè)模型對(duì)這些指標(biāo)的預(yù)測(cè)效果較差（表4）。

表4 驗(yàn)證集樣品評(píng)價(jià)定標(biāo)模型預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Results of validation samples to evaluate MPLS models

3 討論

近紅外光譜技術(shù)作為一種間接測(cè)量方法，其預(yù)測(cè)模型的優(yōu)劣往往會(huì)受到諸多因素影響，其中包括儀器的性能和工作條件、定標(biāo)樣品的數(shù)量和代表性、粉碎粒徑及均勻度、化學(xué)分析值的誤差大小以及光譜處理方法等都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響［18］。應(yīng)用NIRS技術(shù)快速評(píng)價(jià)牧草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是配制動(dòng)物日糧的關(guān)鍵［19］，苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的粗飼料因其營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好，家畜采食量高而在全世界被廣泛種植，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量研究，且取得了比較滿意的成果。

早在1976年Norris以苜蓿、高羊茅（Festuca arundinacea）和雀麥草（Cynodondactylon）為研究對(duì)象，預(yù)測(cè)了 CP，ADF，NDF，ADL，IVDMD 和DMI［20］。Gislum［21］等成功建立了多年生黑麥草和紫羊茅的CP含量預(yù)測(cè)模型，取得了很好的預(yù)測(cè)效果，預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的相關(guān)系數(shù)在0.97～0.98之間。Dale應(yīng)用NIRS建立苜蓿CF，NDF，ADF含量預(yù)測(cè)模型，相關(guān)系數(shù)介于0.93～0.95之間，且RPD均大于4.0［22］，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，NDF和ADF的RPDP值分別為4.18和3.02。石丹［23］等首次建立了適合中國(guó)北方的羊草干草NDF和ADF預(yù)測(cè)模型，這對(duì)于羊草品質(zhì)的快速評(píng)價(jià)、準(zhǔn)確篩選具有重要意義。陳鵬飛［24］等研究表明，青貯苜蓿 DM，ADF，NDF和CP均能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，發(fā)酵品質(zhì)除乙酸和丁酸預(yù)測(cè)較差外，其他指標(biāo)如銨態(tài)氮、pH和乳酸預(yù)測(cè)效果較好；聶志東［25］建立了紫花苜蓿干草和羊草常規(guī)養(yǎng)分含量的預(yù)測(cè)模型，均取得了良好的預(yù)測(cè)效果。許瑞軒［26］等研究了田間快速估測(cè)苜蓿鮮草品質(zhì)對(duì)于適時(shí)刈割的意義，結(jié)果表明DM，NDF，ADF模型可以進(jìn)行粗略的定量分析，且滿足田間快速估測(cè)的要求。

本試驗(yàn)采集了來(lái)源于不同產(chǎn)區(qū)、不同生育期及不同品種的苜蓿干草樣品，樣品分布范圍較廣，化學(xué)成分含量變異較大，具有較強(qiáng)的代表性，且所有的試驗(yàn)樣品采取統(tǒng)一的干燥、粉碎和裝樣等前處理方式和化學(xué)分析方法，以消除系統(tǒng)誤差的影響。RFV，NDF，CP，ADF等的 RPDCV 值均高于3，說(shuō)明NIRS技術(shù)能夠用于這些指標(biāo)的實(shí)際含量分析。

牧草中的營(yíng)養(yǎng)成分是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)，但含量的高低不能反映被家畜消化、代謝和利用的程度。研究牧草的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，分析牧草被家畜利用狀況，能夠更深層次地判定牧草的實(shí)際營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［27］。胡超等應(yīng)用NIRS技術(shù)，采用不同的回歸算法和光譜預(yù)處理方法，建立了菊苣IVDMD的預(yù)測(cè)模型，IVDMD預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.95，結(jié)果表明NIRS預(yù)測(cè)菊苣IVDMD是可行的［28］。嚴(yán)旭等的結(jié)果與此類似，NIRS能夠?qū)厦Ⅺ淚VDMD進(jìn)行準(zhǔn)確分析，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)大于0.94，RPD為6.62［29］。本試驗(yàn)中，IVDMD 的 RPDP 為2.51，能夠用于日常分析，但是NDFD和ADFD預(yù)測(cè)不成功，這主要是由于該試驗(yàn)中苜蓿干草樣品是在體外發(fā)酵培養(yǎng)，瘤胃液活性受動(dòng)物個(gè)體、年齡、身體狀況等方面的影響［30］，并對(duì)試驗(yàn)誤差的放大效應(yīng)所致。Brogna［31］等研究了定標(biāo)集樣本數(shù)共316、驗(yàn)證集299的意大利苜蓿干草的NDFD的預(yù)測(cè)模型，結(jié)果表明NIRS能夠?qū)σ獯罄俎DFD進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，進(jìn)一步說(shuō)明NIRS準(zhǔn)確性的高低取決于足夠多的樣本數(shù)量且能夠代表樣本整體的差異性，涵蓋品種、年際間、生長(zhǎng)條件、收獲時(shí)期、干燥方式等方面的差異性。

牧草可提供能值的高低也是評(píng)定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要依據(jù)［32］。牧草中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成及其消化率均可導(dǎo)致能值的不同［33］。Krachunov［34］利用 NIRS預(yù)測(cè)苜蓿中ME的含量，SEC和SEP分別僅為0.20和0.24。本試驗(yàn)中ME的SEC和SEP分別為0.16和0.28，RPDCV和RPDP均低于2，預(yù)測(cè)效果較差，一方面可能由于ME最大值與最小值偏差較小；另一方面由于ME是通過(guò)ADF和CP化學(xué)值計(jì)算而得，計(jì)算結(jié)果很大程度上依賴于各自化學(xué)值的準(zhǔn)確度，誤差受到不同指標(biāo)測(cè)定步驟的增加而累積，導(dǎo)致ME誤差隨著計(jì)算公式進(jìn)一步擴(kuò)大［35］。

本研究中對(duì)DM，EE，Ash，Ca，P等的預(yù)測(cè)效果較差這一結(jié)論與李潔等研究結(jié)果一致［36］，除樣品間差異性較小、實(shí)驗(yàn)室測(cè)定誤差較大等原因之外，樣品中這些成分在生物體內(nèi)的含量少，靈敏度低，礦物質(zhì)與近紅外光譜反映的有機(jī)物結(jié)構(gòu)信息關(guān)系較差等均會(huì)導(dǎo)致預(yù)測(cè)效果較差［37］。

4 結(jié)論

本研究采集了我國(guó)苜蓿主要產(chǎn)區(qū)的干草草捆樣品，探討了利用NIRS技術(shù)建立苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及消化率的預(yù)測(cè)模型，其中 RFV，CP，NDF，ADF，IVDMD等預(yù)測(cè)結(jié)果良好，可用于苜蓿的快速評(píng)價(jià)和實(shí)際含量分析；但是礦物質(zhì)元素、脂肪等低靈敏度成分的含量，仍需沿用傳統(tǒng)檢測(cè)方法，或進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行優(yōu)化。后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大取樣范圍并加強(qiáng)年際間苜蓿樣品的收集，對(duì)模型進(jìn)行持續(xù)的維護(hù)和更新；還需要篩選結(jié)果重現(xiàn)更佳的能量和消化率檢測(cè)方法，降低化學(xué)測(cè)定的誤差，從而實(shí)現(xiàn)苜蓿草產(chǎn)品品質(zhì)的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)與廣泛應(yīng)用。