腸桿菌20yhhs基因的克隆及功能分析

吳玉+謝銳萍+王雅楠+向雪梅+張欣+曹高燚

摘 要：利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物，是當前利用草甘膦的主要途徑，然而，優良草甘膦抗性基因資源的缺乏是限制抗草甘膦轉基因作物發展的限制因素，挖掘新型草甘膦抗性基因資源勢在必行。極端環境微生物是分離重要功能基因的資源庫。研究分離獲得了一株高抗草甘膦菌株腸桿菌20，為解析其高抗草甘膦脅迫的分子機制，基于非靶位點草甘膦抗性機理，利用原核表達系統鑒定了其草甘膦離子轉運相關基因yhhs的功能，進而對腸桿菌20耐受高度草甘膦脅迫的分子機制進行了討論。

關鍵詞：腸桿菌；草甘膦；分子機理；極端環境

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.09.006

Abstract： Performing genetic engineering to cultivate glyphosate resistant crops was the main pathway for the current utilization of glyphosate. However， lack of excellent glyphosate resistance gene resources was limiting factor and restrict the development of glyphosate-resistant crops. So it was imperative to excavate new glyphosate resistance gene resources through various methods. Extreme environmental microbes are a repository of important functional genes. Here， a high glyphosate-resistant Enterobacter. E 20 was isolated and to be explored its mechanism of glyphosate tolerance. Based on the non-target glyphosate resistance mechanism， an transporter yhhs of Enterobacter. E 20 involved in ion transport possibly was identified and functional analyzed. Further，the molecular mechanisms of Enterobacter. E 20 for high glyphosate tolerance were well discussed.

Key words： Enterobacter； glyphosate； molecular mechanism； extreme environment

雜草問題是制約我國農作物種植面積和作物產量的重要因素之一。適時去除雜草對農作物的危害是關乎農業生產安全的重要工作。草甘膦具有高效、低毒、在環境中降解快、廣譜滅生等優良特性，且制備工藝簡單，使其在幾十年間迅速發展成為當今農業生產中生產量及銷量最大、使用面積最廣的一種除草劑。同時隨著現代農業和生物技術的發展，利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物是當前利用草甘膦的主要途徑[1]。

草甘膦的作用機理主要是競爭性地抑制莽草酸途徑中的催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和莽草酸-3磷酸（S3P）生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）[2]。草甘膦是PEP的結構類似物，其作為EPSPS的抑制因子，可以占據EPSPS與底物結合的活性位點，導致莽草酸途徑受阻，進而使植物體內莽草酸大量積累，最終使植物產生草甘膦毒害，達到消滅雜草的目的[3]。

植物獲得草甘膦抗性，主要通過以下4個途徑：（1）過量表達EPSPS。削弱草甘膦對莽草酸途徑的抑制效應，達到抗草甘膦的目的[4]。（2）定點突變EPSPS。通過對EPSPS關鍵位點的定向改變，使其一方面增強與底物PEP和S3P的親和能力，另一方面削弱草甘膦與EPSPS的結合作用，維持莽草酸途徑的正常進行[5]。（3）降解草甘膦。來源于微生物的草甘膦乙酰轉移酶或草甘膦氧化還原酶等在植物體內可以降解草甘膦，使草甘膦能夠通過乙酰化作用生成無毒的肌氨酸或氨甲基膦酸，或者氧化還原生成乙醛酸和氨甲基膦酸，一定程度解除草甘膦的毒害作用[6]。（4）非靶位點草甘膦抗性途徑。草甘膦并沒有直接作用于EPSPS，草甘膦也沒有被降解而得到解毒，而是通過溫度、離子轉運等途徑降低了草甘膦對生物體的傷害[7]。

抗草甘膦轉基因作物在國內外得到了飛速的發展。然而，困擾抗草甘膦轉基因作物發展的一個重要因素就是稀缺的基因資源[8-9]，挖掘新型草甘膦抗性基因資源勢在必行。非靶位點的草甘膦抗性機理更多的是涉及到草甘膦的重新包裝和及時運輸，使草甘膦的靶標EPSP合酶不受到明顯的影響，維持莽草酸途徑的正常進行，為下游分支酸及多種化合物的合成提供材料來源。

為了補充完善草甘膦抗性基因資源，本研究前期分離了一株新型草甘膦抗性菌株腸桿菌20（Enterobacter. E 20）。該菌株在營養缺陷型培養基中能夠耐受高達400 mmol·L-1的草甘膦的脅迫[1]，具有分離克隆草甘膦抗性基因的潛在價值，為了挖掘草甘膦抗性相關基因，對其進行了全基因組測序（Genbank：CP012999.1）。腸桿菌20其EPSPS編碼基因aroA20的草甘膦抗性并不顯著[1]，為解析腸桿菌20高抗草甘膦脅迫的分子機制，基于非靶位點草甘膦抗性的作用機理，分離鑒定了腸桿菌20中一個編碼膜轉運蛋白的基因20 yhhs，利用原核表達系統對該基因進行了功能鑒定。endprint

1 材料和方法

1.1 試驗材料

限制性內切酶購自New England Biolabs公司，普通Taq酶、TransStart FastPfu DNA Polymerase（AP222）、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒及pEASY-Blunt Simple Cloning Kit（CB111）載體購自北京全式金生物技術有限公司；各類抗生素購自北京中科瑞泰生物技術有限公司。大腸桿菌DH5α，aroA缺陷型菌株ER2799由中國農業科學院作物科學研究所玉米分子生物學實驗室保存。引物由北京生工生物工程有限公司合成，序列測定由中國農業科學院作物科學研究所開放實驗室測序部完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 草甘膦抗性菌株的篩選 草甘膦極端污染的土壤取自草甘膦生產工廠的廢水排出處，該處土壤受到多年草甘膦的嚴重污染。小心取出部分土壤，用去離子水溶解，采用稀釋涂板培養細菌的方法，取上清液，稀釋到106，在含有不同濃度（0～400 mmol·L-1）草甘膦的M9固體培養基上進行培養。將能夠生長的草甘膦抗性菌落轉接劃線于新的 M9 固體培養基上進行菌株純化，最后將篩選到的草甘膦抗性菌株用液體 LB 培養基進行培養，加入15%體積比的甘油，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2.2 細菌基因組DNA的提取 細菌基因組DNA提取參照北京全式金生物技術有限公司EasyPureTM Genomic DNA Kit說明書（貨號EE101）進行，提取的基因組DNA儲存于-20 ℃。腸桿菌20基因組測序由中國科學院北京基因組研究所完成（Genbank：CP012999.1）。

1.2.3 細菌16Sr DNA的擴增 提取細菌基因組DNA后，用16Sr DNA引物進行擴增，鑒定微生物所屬的類型。所用引物為：上游5‘-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3；下游5‘-TACG GTTACCTTGTTACG ACTT-3。PCR反應體系為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環30次；72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。PCR擴增片段經DNA純化試劑盒純化后連接T載體進行測序，并在NCBI 在線網站中進行序列比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.4 20 yhhs的擴增及原核表達載體構建 基于腸桿菌20全基因組測序結果，鑒定20 yhhs基因序列（Genbank：ALL19477.1），利用Clontech公司的In-Fusion連接系統（In-Fusion？誖 PCR Cloning System），構建原核表達載體pUC19-20yhhs。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環30次；72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。所用引物為：Infu- puc- 20yhhs-BamH：CGGTACCCGGGGATCCGA TGCCCGAACCTGCCGCT；Infu-puc-20yhhs-Sal：ATGCCTGCAGGTCGACTCACGACG ATGACGTGGCCT。

PCR擴增產物經電泳檢測后，直接取PCR原液進行In-Fusion反應，連接至經BamHI/SalI消化的pUC19線性載體片段上，轉化ER2799，涂布在含有AMP的固體LB培養基上，并通過測序進行驗證。

1.2.5 20 yhhs重組菌株的草甘膦抗性鑒定 質粒pUC-20yhhs及對照質粒pUC19分別轉化ER2799，選取同批次轉化的單克隆菌落用含AMP的液體LB培養基培養，之后轉接等量菌液至含有不同濃度草甘膦的液體M9培養基中，37 ℃下200 rpm中振蕩培養，監測重組菌株生長曲線，評價其草甘膦抗性。

2 結果與分析

2.1 草甘膦抗性菌株的分離鑒定

通過稀釋平板法，獲得了數個具有高度耐受草甘膦脅迫的菌斑，對這些菌斑進行了轉接純化，并用不含抗生素的LB液體培養基重新培養，獲得的純化菌株保存于-70 ℃。重點集中于一株能夠穩定耐受高達400 mmol·L-1草甘膦脅迫的菌株，根據鑒定順序，將其命名為20（圖1）。

2.2 細菌基因組DNA的提取及16Sr DNA的鑒定

新分離的20號菌株用不含抗生素的LB培養基重新培養，收集菌液，提取20號菌株的基因組DNA，用16Sr DNA鑒定其所屬種。在 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中 對 菌 株20的16Sr DNA進行序列比對，結果顯示，20菌株很可能是一種腸桿菌，與多個Enterobacter具有較近的親緣關系，其在 NCBI 中的比對結果如表 1 所示。

2.3 20 yhhs基因的克隆及原核表達載體構建

20菌株是一種腸桿菌，其與模式菌株大腸桿菌K12（E.coli. K12）具有較近的親緣關系，而野生型的K12對草甘膦敏感。腸桿菌20其EPSPS編碼基因在之前的鑒定中并未顯示出草甘膦抗性[1]，基于此，推測其可能通過非靶位點途徑獲得草甘膦抗性。

大腸桿菌 yhhs基因編碼一個膜轉運蛋白，在大腸桿菌及假單胞菌中過表達yhhs基因，可以通過離子轉運的作用降低草甘膦對細胞的傷害[10]。腸桿菌20由北京基因組研究所采用新一代測序技術進行全基因組測序（Genbank：CP012999.1），因此掃描腸桿菌20基因組測序結果，以腸桿菌20基因組DNA為模板，獲得了20 yhhs基因（Genbank：ALL19477.1）（圖2）。該基因全長1 218 bp，編碼405個氨基酸?；贗n-Fusion介導的載體構建策略，將該基因克隆至原核表達載體pUC19的BamHI/ SalI酶切位點之間，并在基因起始密碼子前添加一堿基G，以利用載體自身的啟動子驅動該基因的表達，構建載體pUC-20yhhs（圖3），載體經測序驗證正確。endprint

2.4 20 yhhs重組菌株的草甘膦抗性鑒定

為鑒定20 yhhs重組菌株的草甘膦抗性，選擇同批次轉化的重組菌株的單克隆，在含AMP的液體LB培養基中培養至OD600為0.5，之后選取等量的菌液轉接入含不同濃度草甘膦的M9液體培養基中，草甘膦濃度分別設為0，100，200， 300 mmol·L-1，于37 ℃，220 rpm下振蕩培養，并在不同的時間點取樣測定OD600，評價重組菌株對草甘膦的耐受性。

ER2799不具有在草甘膦脅迫下在缺陷型培養基中生長的能力[11]，從圖4可以看出，含質粒pUC19及pUC-20yhhs的重組菌株在不同濃度草甘膦的脅迫下，都未體現出對草甘膦的耐受型，重組菌株一直處于嚴重的抑制狀態下。說明20 yhhs并未通過離子轉運作用賦予重組菌株草甘膦抗性，腸桿菌20高抗草甘膦的作用機制還有待進一步研究。

3 結論與討論

極端環境微生物是獲得重要抗性基因的來源，有報道表明，大量參與耐重金屬、低溫、高溫及草甘膦脅迫的功能基因被克隆并被廣泛地應用[11]。在草甘膦抗性植物研究領域，由土壤農桿菌分離而來的CP4被廣泛應用于抗草甘膦轉基因作物的培育，由于其100位氨基酸為特異的Ala，而不同于大多數I型EPSPS為Gly及II型EPSPS為Ser，獨特的空間構型增強了與底物PEP及S3P的親和能力，而同時降低了草甘膦對EPSPS的抑制[11]。

莽草酸途徑廣泛存在于植物、微生物及真菌中，其中，莽草酸是很多化合物合成的前體，成為很多抗菌劑、活性疫苗及除草劑的重要靶標[12]。EPSPS是莽草酸途徑中催化S3P和PEP合成EPSP的關鍵酶，草甘膦作為PEP的結構類似物，會競爭性地抑制EPSPS的活性，進而影響莽草酸途徑的正常進行，嚴重的會導致生物體死亡，因此，草甘膦抗性研究的熱點較大程度地集中于EPSPS。

腸桿菌20是從草甘膦極端污染土壤中分離而來的菌株，16Sr DNA鑒定結果顯示其為腸桿菌[1]。為了探究其高度耐受草甘膦脅迫的分子機制，對其進行了全基因組測序（Genbank：CP012999.1），并分離了其EPSPS編碼基因aroA20，進化分析顯示，20 EPSPS為I型EPSPS，然而，對aroA20進行初步的草甘膦抗性鑒定，并未顯示其具有顯著的草甘膦耐受性[1]。

非靶位點草甘膦抗性是生物體獲得抗草甘膦能力的另外一條重要途徑[13-14]，非靶位點草甘膦抗性機制的研究更多地集中于歐美及澳大利亞等地區出現的草甘膦抗性雜草上。草甘膦抗性雜草相對于敏感雜草，有比較強的草甘膦轉運能力，可將草甘膦轉移至EPSP合酶的非主要作用細胞器（如液泡），隨之進行解毒，避免過多的草甘膦進入葉綠體，從而解除草甘膦對自身的傷害[7]。因此，挖掘轉運和解毒草甘膦的關鍵基因，對于研究非靶位點草甘膦抗性機制具有重要的意義，并為作物耐草甘膦育種提供理論依據。yhhs基因作為離子轉運蛋白，過表達可以賦予大腸桿菌及假單胞菌耐受草甘膦的能力[10]，然而，本研究結果表明，20 yhhs在原核表達系統中卻并未賦予腸桿菌20高抗草甘膦的能力。

腸桿菌20高抗草甘膦脅迫，而其草甘膦抗性并未通過yhhs基因的離子轉運作用獲得。通過掃描腸桿菌20全基因組數據，并結合草甘膦脅迫下腸桿菌20基因的表達譜，將有助于闡明腸桿菌20高度耐受草甘膦脅迫的分子機制。

參考文獻：

[1]曹高燚. 草甘膦抗性基因的篩選鑒定及功能分析[D]. 北京： 中國農業大學， 2013.

[2]STEINRUCKEN H C， AMRHEIN N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase[J]. Biochem biophys res commun， 1980， 94（4）： 1207-1212.

[3]CAO G， LIU Y， ZHANG S， et al. A novel 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase shows high glyphosate tolerance in Escherichia coli and tobacco plants[J]. Plos one， 2012， 7（6）： e38718.

[4]GAINES T A， ZHANG W， WANG D， et al. Gene amplification confers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri[J]. Proc natl acad sci U S A， 2009， 107（3）： 1029-1234.

[5]FUNKE T， YANG Y， HAN H， et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli[J]. J biol chem， 2009， 284（15）： 9854-9860.

[6]CASTLE L A， SIEHL D L， GORTON R，et al. Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene[J]. Science， 2004， 304： 1151-1154.endprint

[7]GE X， DAVIGNON D A， ACKERMAN J J， et al. Rapid vacuolar sequestration： the horseweed glyphosate resistance mechanism[J]. Pest manag sci， 2010， 66（4）： 345-348.

[8]王冰， 杜錦， 向春陽， 等. 草甘膦抗性菌株假單胞菌P818的篩選鑒定[J].天津農業科學， 2016， 22（1）： 27-31.

[9]李敬娜，劉亞，李翔，等.抗草甘膦基因表達載體的構建及對玉米的遺傳轉化[J].華北農學報，2010（4）：44-48.

[10]STAUB J M， BRAND L， TRAN M， et al. Bacterial glyphosate resistance conferred by overexpression of an E. coli membrane efflux transporter[J]. J ind microbiol biot， 2012， 39（4）： 641-647.

[11]FUNKE T， HAN H， HEALY-FRIED M L， et al. Molecular basis for the herbicide resistance of roundup ready crops[J]. Proc natl acad sci U S A， 2006， 103（35）： 13010-13015.

[12]TZIN V， GALILI G. New insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants[J]. Mol plant， 2010， 3（6）： 956-972.

[13]YUAN J S， TRANEL P J， STEWART C N， et al. Non-target-site herbicide resistance： a family business[J]. Trends plant Sci， 2007， 12（1）： 6-13.

[14]TSUI M T， CHU L M. Environmental fate and non-target impact of glyphosate-based herbicide （Roundup） in a subtropical wetland[J]. Chemosphere， 2008， 71（3）： 439-446.endprint