大鱗副泥鰍腸道黏液細胞及消化酶活性分布特征研究

劉亞秋李新輝王志堅

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 廣州 510380; 2. 西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 水產科學重慶市市級重點實驗室, 重慶 400715)

大鱗副泥鰍腸道黏液細胞及消化酶活性分布特征研究

劉亞秋1,2李新輝1王志堅2

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 廣州 510380; 2. 西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 水產科學重慶市市級重點實驗室, 重慶 400715)

采用阿利新蘭-碘酸雪夫氏反應(AB-PAS)染色法及酶學方法研究了大鱗副泥鰍成熟個體腸道各段黏液細胞分布及消化酶活性。結果表明, 大鱗副泥鰍腸道黏液細胞分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型。前腸至后腸,黏液細胞數量逐漸減少。前腸主要分布Ⅲ和Ⅳ混合型黏液細胞, 后腸則以Ⅱ和Ⅳ型酸性黏液細胞為主。腸道胰蛋白酶活性顯著高于淀粉酶和脂肪酶。且后腸消化酶活性顯著低于前腸和中腸。根據黏液細胞及消化酶活性分布特點, 表明大鱗副泥鰍屬于雜食性魚類, 前腸為其主要的消化吸收場所, 后腸中性黏液細胞的數量較少以及消化酶活性較低, 表明其對食物的消化吸收功能較弱, 與其為輔助呼吸功能的特點相關。

黏液細胞; 消化酶; 大鱗副泥鰍; 腸道

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus), 隸屬于鯉形目, 花鰍科, 副泥鰍屬, 是一種底棲生活的小型經濟魚類。目前廣泛分布于東南亞等地區, 在中國主要分布在長江中下游以及珠江流域[1]。其肉質鮮美, 營養豐富, 常出沒于沼澤, 水田, 池塘等低氧環境。大鱗副泥鰍、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)等, 在低氧的情況下, 喜歡吞食氣泡, 存在腸道輔助呼吸的特點。劉亞秋等[2]研究表明, 大鱗副泥鰍前中后部腸道組織結構特點差異顯著, 后腸為其主要進行輔助呼吸的部位。目前關于大鱗副泥鰍的研究在生長與年齡、遺傳多樣性以及雜交育種等方面已有文獻報道[3—6]。而對于其兼具消化與呼吸功能的腸道黏液細胞及消化酶活性分布特點尚未見報道。因此, 本研究通過對大鱗副泥鰍腸道各段黏液細胞類型、分布密度、黏蛋白分布特點及消化酶活性分布差異進行研究, 結合其生存環境特點, 對其腸道各部組織化學及消化生理特點進行初步探討, 以期對其腸道各區域結構與功能間關系提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

大鱗副泥鰍成熟個體來自于實驗室大棚養殖池塘, 暫養魚實驗室循環水缸內馴養2周, 自然光照,不間斷充氣, 水質參數如下: 21—23℃, 溶氧: (7.15± 0.58) mg/L, pH 7.1—7.8。取大鱗副泥鰍性成熟個體30尾雌雄各半, 測量體長、體重、腸長及腸重。隨機選取其中15大鱗副泥鰍, 雌雄根據其特征進行分類(雌雄比例為6:9)。雌雄各隨機取3尾, 進行切片觀察; 其余15尾中, 隨機選取6尾用于腸道各部消化酶活性測定。

1.2 方法

樣本制備與顯微觀察 成魚腸道的組織學材料用Bouin’s試液固定, 保存于70%酒精。酒精梯度脫水, 常規石蠟包埋, 切片5—7 μm, 分別以橫向方式進行切片, 采用阿利新藍(Alcian blue, AB)、過碘酸-雪夫(Periodicacid-Schiff, PAS)以及阿利新藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)方法染色, 中性樹膠封片。

阿利新藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色, 將大鱗副泥鰍黏液細胞分為4種類型: Ⅰ型為紅色, 阿利新藍(AB)反應陰性, 過碘酸-雪夫(PAS)反應陽性, 含有中性黏多糖; Ⅱ型為藍色, 阿利新藍(AB)反應陽性, 過碘酸-雪夫(PAS)反應陰性, 含有酸性黏多糖;Ⅲ型為紫紅色, 阿利新藍(AB)與過碘酸-雪夫(PAS)反應均為陽性, 主要含有過碘酸-雪夫(PAS)反應陽性的中性黏多糖; Ⅳ型為藍紫色, 阿利新藍(AB)與過碘酸-雪夫(PAS)反應均為陽性, 主要含有阿利新藍(AB)反應陽性的酸性黏多糖[7]。根據阿利新藍(AB)(pH 2.5和1.0)、過碘酸-雪夫(PAS)染色的深淺表示其黏蛋白組織化學反應的強弱[8]。

制片后采用NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統觀察、照相。腸道各段隨機取3張切片進行指標測量, 每張切片隨機選10個視野, 分別計數每一視野中100 μm×100 μm范圍內各類型黏液細胞的總數, 作為該類型黏液細胞的密度; 每項指標采用Image-Pro Plus (IPP)圖像分析軟件進行測量。

樣品采集與酶活性測定 魚體置于冰盤上,以免消化酶失活。用重物猛擊其頭部, 迅速處死魚,分別剪取其前腸、中腸、后腸和肝胰臟等組織塊,快速置于液氮固定并置于–80℃超低溫冰箱保存,用于進一步消化酶測定。

從冰箱中取出待測樣品, 置于冰上解凍。解凍完成后將樣品稱重, 按質量: 體積為1∶4加入勻漿稀釋液, 分別對每尾魚肝胰臟、前腸、中腸、后腸以勻漿器進行勻漿。所得勻漿液用低溫超速離心機4℃, 3000 r/min轉速離心20min后取上清液用于消化酶活力測定。實驗中的消化酶及可溶性蛋白均使用南京建成公司生產的試劑盒檢測。在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白質中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003定義為1個胰蛋白酶活力單位。在37℃條件下, 每克組織蛋白在反應體系中與底物反應1min, 每消耗1 umol底物定義為1個脂肪酶活力單位。組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位。本實驗使用全波長酶標儀(Thermo)和紫外分光光度計(UV-2450)測定吸光度。

數據分析 采用單因子方差分析(ANOVA)檢驗腸道各部黏液細胞分布密度、肝胰臟以及腸道各部消化酶活性差異顯著性。如差異顯著, 則采用多重比較方法比較平均數之間的差異。顯著性水平為0.05。數據分析采用SPSS 19.0統計軟件進行。實驗數據均用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果

2.1 大鱗副泥鰍腸道形態及腸道系數

大鱗副泥鰍無胃, 食道較短緊接腸道, 腸道始端膨大, 呈長管狀。大鱗副泥鰍腸道整體位于腹腔底部, 頭部背肝臟覆蓋。腸道可劃分為前腸、中腸和后腸三部分, 腸道螺旋彎曲前部稱為前腸, 向后至第二處輕微彎曲為中腸, 彎曲至肛門段為后腸。后腸管腔狹窄, 腸壁薄而透明, 且布滿血管(圖 1)。腸道系數如表 1所示。

2.2 腸道黏液細胞分布情況

腸道各部黏液細胞的分布特點及密度 大鱗副泥鰍腸道上皮為單層柱狀上皮, 上皮細胞之間含有豐富黏液細胞。AB-PAS染色結果顯示, 腸道黏液細胞形狀各異, 呈杯狀、囊狀、圓球狀等不同形態, 有Ⅰ- Ⅳ型4種黏液細胞(圖 2)。前腸黏液細胞豐富多為Ⅲ和Ⅳ型黏液細胞, 多呈杯狀和囊狀,后腸腸壁很薄, 多為Ⅱ型黏液細胞。腸道各段黏液分布密度如表 2所示, 前腸Ⅰ、Ⅲ、 Ⅳ型黏液細胞數量顯著多于中腸和后腸(P＜0.05), 中腸次之, 后腸缺乏Ⅰ和Ⅲ型黏液細胞。相較之下, 后腸Ⅱ型黏液細胞數量要顯著多于前腸和中腸(P＜0.05)。

腸道黏蛋白的分布特點 后腸的阿利新藍(AB) (pH 0.5、1.0和2.5)反應強度高, 表明該部位硫酸基(-SO3H)和羧基(-COOH)的酸性黏液物質豐富。前腸道上皮黏蛋白過碘酸-雪夫(PAS)反應強度高于中腸和后腸, 表明腸道前部內中性黏液物質分泌能力強。且前腸和后腸阿利新藍(AB)(pH 2.5和1.0)反應強度高于中腸(表 3)。

圖 1 大鱗副泥鰍腸道

表 1 大鱗副泥鰍腸道形態學基礎參數Tab. 1 Basic intestinal tract morphological parameters in P. dabryanus

圖 2 大鱗副泥鰍腸道黏液細胞

表 2 大鱗副泥鰍腸道黏液細胞的分布密度(細胞數個/mm2)Tab. 2 Mucous cells distribution density of in the intestine of P. dabryanus (cell/mm2)

表 3 大鱗副泥鰍腸道黏蛋白組織化學反應情況Tab. 3 Mucin histochemistry reaction in the intestinal tract of P. dabryanus

2.3 消化酶活性分布情況

大鱗副泥鰍腸道消化酶活性分布如圖 3所示,中腸淀粉酶活性相對最高為(0.45±0.05) U/mg protein, 腸道各段淀粉酶活性差異不顯著(P＞0.05), 但均顯著高于肝胰臟(P＜0.05)。大鱗副泥鰍肝胰臟脂肪酶活性相對最低(0.17±0.02) U/mg protein, 顯著低于腸道各部(P＜0.05)。后腸脂肪酶活性顯著低于前腸和中腸(P＜0.05), 而前腸與中腸脂肪酶活性差異不顯著(P＞0.05)。前腸胰蛋白酶活性最高(5089.06± 295.94) U/mg protein, 顯著高于肝胰臟以及腸道其他各部(P＜0.05)。中腸次之, 其次為肝胰臟。后腸為大鱗副泥鰍胰蛋白酶活性最低的部位。堿性磷酸酶活性在前腸的活性最高(36.13±4.36) U/mg protein (P＜0.05), 其次是中腸, 在肝臟以及后腸的活性較低。

3 討論

組織化學觀察發現, 大鱗副泥鰍前腸黏液細胞數量顯著多于中后腸, 且含有豐富的I和III型黏液細胞。豐富的黏液物質可以潤滑食物, 減少食物對腸黏膜的機械損傷[9]。中性黏液物質可以和堿性磷酸酶共存, 并且具有調節消化道pH以及輔助消化功能[10]。后腸中黏液細胞基本為酸性, 中性黏液細胞顯著減少, 導致后腸喪失了吸收部分營養物質的功能。有學者對岡特似鱗頭鰍(Lepidocephalichthys guntea)[11]和側斑兵鲇(Corydoras aeneus)[12]的研究發現, 其腸道后部分泌大量硫酸基(-SO3H) 和羧基(-COOH)的酸性黏液物質的特點與其特殊的腸道輔助呼吸功能相關。Leknes[13]則認為, 呼吸上皮酸性黏液物質更多是對保護頻繁充入外界干燥空氣的脆弱呼吸上皮的一種保護。覓食期間, 腸呼吸魚類的腸道處于食物高度充塞情況下, 氣體如何到達呼吸上皮進行氣體交換生理機制還不明確。有研究表明, 腸輔助呼吸時, 大量空氣的吞入促進未消化的食物排出體外[13,14]。Moitra等[11]研究表明分泌的酸性黏液物質起到一定潤滑作用, 并能保持呼吸上皮區域的干凈。且進行氣呼吸時氣體交換保持了穩定的酸性環境, 這也是多數具有輔助呼吸功能的魚類氣呼吸器官的共有特征[15—17]。

圖 3 大鱗副泥鰍腸道消化酶活性分布

研究結果表明, 大鱗副泥鰍前腸和中腸的胰蛋白酶活性較高, 后腸胰蛋白酶活性較低, 這與肉食的歐鲇(Silurus glanis)和雜食性的尼羅羅非魚(Nile tilapia)類似[18,19]。前腸和中腸的胰蛋白酶高于肝胰臟, 這與鯉形目的草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鯉(Cyprinus carpio)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)等相似[20]。這可能是由于肝胰臟主要分泌蛋白酶原, 這種酶原的蛋白酶活性微弱, 當蛋白酶原進入腸道前部后受到腸道分泌的腸激酶的激活才有較強活性, 所以導致腸道的胰蛋白酶的活性要顯著高于肝胰臟[21—23]。淀粉酶以及脂肪酶也檢測出類似情況。相較而言, 大鱗副泥鰍腸道胰蛋白酶活性顯著高于淀粉酶和脂肪酶, 這與大鱗副泥鰍食物餌料來源的成分相關。后腸堿性磷酸酶活性顯著低于腸道其他各部。有研究表明, 堿性磷酸酶主要存在于魚類腸道上皮細胞的淺部和紋狀緣上, 是一種可幫助腸上皮細胞吸收的金屬酶, 與多種營養物質的吸收存在正相關性,是消化生理的研究的重要指標[19,24,25]。比較腸道各段消化酶活性, 大鱗副泥鰍后腸消化酶要低于腸道其他各部。可能是由于前腸、中腸為其主要的消化與吸收場所, 而后腸對于食物的消化能力很弱,這也與其后腸黏液細胞分布特點一致。

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STUDY ON DISTRIBUTION CHARACTERISTICS OF INTESTINAL MUCOUS CELLS AND DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES IN PARAMISGURNUS DABRYANUS

LIU Ya-Qiu1,2, LI Xin-Hui1and WANG Zhi-Jian2
(1. Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, the Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Distribution of mucous cells and digestive enzyme activities in the intestinal tract of Paramisgurnus dabryanus were analyzed by AB-PAS histochemical staining and enzymatic testing techniques. The results showed that there were four types of P. dabryanus intestinal tract mucous cells (Ⅰ–Ⅳ). The number of mucous cells decreased from the anterior to posterior intestinal tract. The types of mucous cells in anterior intestinal tract were mainly mixed Ⅲ and Ⅳtypes. The mucous cells, however, consisted of mainly Ⅱ and Ⅳ acidic types in the posterior intestine. Trypsin activity was significantly higher than amylase and lipase activities. Digestive enzyme activities in the posterior intestine were lower than that in the anterior and middle intestine. According to distribution characteristics of the intestinal mucous cells and digestive enzyme activities, P. dabryanus appears to be a type of polyphagic fish. Its intestinal tract has digestion and respiratory functions. Digestion and absorption occur in the anterior intestine. In the posterior intestine, the lack of neutral mucus cells and low digestive enzyme activities indicate that its digestive and absorptive abilities are weak. It may be related to its assistive respiratory function.

Mucous cell; Digestive enzyme; Paramisgurnus dabryanus; Intestine

Q954.6

A

1000-3207(2017)05-1048-06

10.7541/2017.131

2016-11-15;

2017-02-18

公益性行業專項(農業)科研專項(201203086)資助 [Supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201203086)]

劉亞秋(1990—), 男, 湖北武漢人; 碩士; 主要研究方向為漁業生態與環境。 E-mail: liuyq1990@foxmail.com

王志堅(1969—), 男, E-mail: wangzj1969@126.com