碳納米管對樹突狀細胞成熟和T細胞分化作用研究

代亞麗 聶 欣 劉 健 孟 潔 許海燕

(中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京協和醫學院基礎學院，北京 100005)

碳納米管對樹突狀細胞成熟和T細胞分化作用研究

代亞麗 聶 欣 劉 健#孟 潔#*許海燕#*

(中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京協和醫學院基礎學院，北京 100005)

Th分化在免疫應答過程中起著關鍵性的作用，主要由樹突狀細胞來調控。碳納米管是由碳元素組成的空心管狀納米材料，可作為抗原載體。碳納米管對樹突狀細胞和Th分化的影響是決定其免疫響應的關鍵因素。分析氧化多壁碳納米管(CNT)對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)功能的影響，以及對過敏抗原多肽OVA323-339的 Th1和Th2免疫反應的影響。實驗結果顯示，BMDCs大量吞噬CNT，但對其細胞表面活化標志分子CD86、MHCII以及細胞因子TNF-α表達沒有明顯變化。CNT/抗原復合物可促進BMDCs表面MHCII的表達和CD8+T細胞增殖，增殖細胞的比例由28.7%分別增加到40.6%、41.3%和29.6%。Th2型細胞因子IL-4、IL-13和IL-10的表達和CD4+T的增殖受到抑制，增殖細胞的比例由54.4%減少到38.9%、46.6%和39.8%。研究結果提示，CNT不影響DCs的成熟和活化，但CNT可以影響過敏抗原的Th分化平衡，可抑制Th2型細胞因子的表達，促進Th1型免疫響應。

樹突狀細胞；碳納米管；Th分化；抗炎細胞因子；過敏抗原

引言

碳納米管具有典型的納米結構和高比表面積，可以與生物大分子結合，易透過細胞膜被多種細胞攝取，可以作為生物分子的高效載體[1-5]。有研究將碳納米管與手足口病多肽抗原結合，發現與傳統的鋁佐劑相比，碳納米管引起了更強的特異性抗體產生[6]，可顯著地促進半抗原特異性抗體產生[7]。此外，有研究稱多壁碳納米管可加重小鼠的過敏性呼吸道炎癥反應[8-9]。

Th分化在免疫應答過程中起著關鍵性的作用，其中Th1分化促進CD8效應細胞的細胞毒及吞噬功能，Th2分化促進B細胞產生抗體[10-11]。Th2分化在過敏反應過程中發揮著關鍵作用， Th2型細胞因子(特別是IL-4和IL-13)可激活Th2型免疫反應[12-13]。OVA323-339多肽是卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的過敏抗原表位，主要與MHCII分子結合，引起過敏反應[14]。碳納米管是否促進過敏抗原的免疫效應，是值得關注的問題。本研究制備了水分散性的氧化多壁碳納米管，通過透射電鏡、特異性抗體、ELISA試劑盒等，檢測了碳納米管及其負載OVA323-339抗原后對小鼠骨髓細胞來源的樹突狀細胞和淋巴細胞活化情況的影響，分析氧化多壁碳納米管對過敏抗原免疫反應的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

健康雌性C57BL/6小鼠購自維通利華動物技術有限公司，重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)購自PEPROTECH公司，卵清蛋白抗原多肽OVA323-339購自南京金斯瑞生物科技有限公司，CpG寡聚核苷酸(ODN 1826)購自InvivoGen公司，抗小鼠CD11c、MHC II、CD86、CD4和CD8以及小鼠IL-4、IL-10、IL-13和TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司，原始多壁碳納米管(50 μm)購自中科院成都有機化學有限公司。

1.2 碳納米管的氧化處理

多壁碳納米管的氧化過程參考文獻[15]的方法，將原始多壁碳納米管加入到混合濃酸中(濃硝酸∶濃硫酸=1∶3)，超聲探頭處理后純水洗滌至中性并干燥，得到氧化碳納米管(oxidized carbon nanotubes，CNT)。將CNT滅菌處理后，在超聲探頭輔助下分散到培養基中，離心收集上清，得到CNT培養基溶液。

1.3 體外誘導、培養小鼠骨髓來源樹突狀細胞

將4周齡C57BL/6小鼠斷頸處死，浸入75% 酒精30 s后，在超凈臺中分離小鼠的股骨和脛骨。剪斷兩端骨帽后用RPMI 1640培養基沖洗骨髓腔，經洗滌、紅細胞裂解后，將含GM-CSF的完全培養基(10 ng/mL GM-CSF、10% FBS)加入到骨髓細胞中。隔天半量換液至第6 d，細胞表面可觀察到明顯的刺突形成，收集懸浮細胞，得到小鼠骨髓細胞來源樹突狀細胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)[16]。將CD11c抗體加入到細胞懸液中，4℃孵育1 h后流式細胞儀(Accuri C6，BD)檢測。將10 μL細胞懸液滴于載玻片上，自然晾干后用瑞士-吉姆薩溶液染色，中性樹脂封片后油鏡(Olympus IX53)觀察細胞形態。

1.4 CNT對BMDCs活性的影響

將不同濃度的CNT(0.01、0.03和0.1 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2培養24 h后收集細胞，將CD11c抗體加入到細胞中。利用流式細胞儀分析CNT對BMDCs活性的影響。在流式散點圖中，活細胞具有較大的前向光(FSC)和側向光(SSC)。通過圈門選出較大FSC和CD11c+細胞在所有細胞中的比例，可分析不同濃度CNT對BMDCs活性的影響。

1.5 BMDCs對CNT的攝取

將CNT(0.03 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2孵育24 h后，收集細胞團。經戊二醛固定、洗滌、鋨酸固定、乙醇脫水和樹脂包埋后，將CNT處理的BMDCs細胞制備成超薄切片后，利用透射電鏡(TEM, JEM-1400-plus)觀察BMDCs對CNT的攝取情況。

1.6 CNT對BMDCs成熟和活化的影響

CNT/CpG混合物的制備：將CNT與CpG充分混合(0.03 mg/mL CNT:1 μM CpG)，室溫放置30 min后，得到均勻穩定的混合液。將不同濃度的CNT溶液(0.01、0.03和0.1 mg/mL)、CpG(1 μM)和CNT/CpG混合液(CpG終濃度為1 μM)加入到BMDCs中，培養箱中培養 24 h后，分別收集上清和細胞。利用ELISA試劑盒檢測上清中TNF-α的表達；利用流式細胞儀，分析BMDCs活化標志分子CD86和MHCII的表達。

1.7 CNT對BMDCs抗原提呈的影響

將OVA323-339(O-3)抗原加入到不同濃度的CNT溶液中，室溫條件下充分混合后放置30 min，得到O-3/CNT抗原復合物。將3種不同CNT濃度的復合物加入到BMDCs中，其中CNT的濃度分別為0.01、0.03和0.1 mg/mL，O-3的終濃度為10 μg/mL，37℃孵育48 h。將MHCI、MHCII抗體加入到復合物處理的BMDCs中，分析CNT對抗原提呈的影響。

1.8 混合淋巴細胞反應

圖1 BMDCs的體外誘導、培養和碳納米管對細胞活性的影響。(a)小鼠骨髓細胞誘導培養6 d后，細胞表面高表達CD11c，細胞表面可見大量刺狀突起，從左到右依次為空白細胞散點圖、CD11c標記后散點圖、BMDCs的CD11c表達柱狀圖以及透射電鏡觀察到的BMDCs的形態圖，內插圖為瑞士-吉姆薩染色的染色圖；(b)不同濃度CNT對BMDCs活性的影響，從左到右依次為對照、0.01、0.03和0.1 mg/mL處理的BMDCs的活細胞比例Fig.1 The induction and cultivation of BMDCs in vitro and the effects of CNT on BMDCs viability. (a) Bone marrow cells were induced to dendritic cells with spikes on the surface of cells and high CD11c expression; The plot of BMDCs cell, CD11c labeled BMDC plot and histogram, and cell morphology observed by TEM were showed from the left to the right. (b) The effect of CNT on BMDCs viability; the viable BMDCs cell ratio treated without CNT, 0.01, 0.03 and 0.1 mg/mL CNT were shown from the left to the right

將六周齡雌性C57BL/6小鼠斷頸處死后，浸泡到75%酒精中30 s。在超凈工作臺中解剖取出小鼠脾臟，研磨過篩得到脾細胞懸液。將細胞懸液緩慢地加入到淋巴細胞分離液上層，400 g室溫離心30 min。輕輕取出中間淋巴細胞層到離心管中，加入PBS清洗2遍后計數。將CSFE加入到淋巴細胞中(終濃度為1 μM)，37℃孵育20 min后離心洗滌，得到CSFE標記淋巴細胞。

將標記后的淋巴細胞加入到不同濃度O-3/CNT復合物處理的BMDCs中，淋巴細胞和BMDCs的比例為10∶1。培養5 d后收集上清和細胞，利用ELISA試劑盒檢測上清中IL-4、IL-13和IL-10的量；利用CD4和CD8抗體標記T淋巴細胞，檢測兩群細胞的增殖情況。

1.9 統計學分析

每個實驗設3個重復樣，數據表示為平均值±標準差。顯著性差異利用SPSS軟件單因素方差分析(ANOVA)進行分析，流式數據用CFlowTM軟件(Accuri Cytometers)和FlowJo軟件(Treestar，美國)進行分析。

2 結果

2.1 碳納米管對BMDCs活性的影響

小鼠骨髓細胞經GM-CSF體外誘導培養6 d后，細胞表面出現典型的刺突結構，高表達DCs特異性標志物CD11c。瑞士-吉姆薩染色顯示，細胞表面有大量褶皺和不規則突起，具有典型的DCs形態。在透射電鏡下觀察到細胞表面有較多的突起，細胞核偏于一側(見圖1(a))。這些結果確定得到的細胞為樹突狀細胞(BMDCs)。

根據CD11c的表達和前向光(FL1-A/FSC)的大小，可在流式散點圖上圈出BMDCs，分析CNT對BMDCs細胞活性的影響。將不同濃度的CNT與BMDCs孵育24 h后，3種濃度的碳納米管都降低了BMDCs的活性，由對照組的89.8%降低到86.9%、87.5%和84.1%，提示CNT對BMDCs活性無明顯影響(見圖1(b))。

2.2 BMDCs對碳納米管的攝取

將CNT與BMDCs孵育24 h后，在透射電鏡下可觀察到CNT被大量吞噬到細胞內，細胞核內未見(見圖2)。被BMDCs吞噬的碳納米管聚集成團，有少量碳納米管單根存在。

圖2 利用透射電鏡觀察BMDCs攝取碳納米管情況。(a)CNT被BMDCs攝取；(b)為(a)的局部放大Fig.2 CNT uptake of BMDCs observed by TEM. (a) CNT was engulfed by BMDCs. (b) The partial magnification of (a)

2.3 碳納米管對BMDCs成熟和抗原提呈的影響

樹突狀細胞攝取抗原或被某些刺激因素處理后逐漸成熟，細胞表面高表達CD86和MHCII分子，同時釋放細胞因子(如TNF-α、IL-12等)。CpG可直接激活樹突狀細胞，上調共刺激分子的表達，加強免疫反應。實驗結果表明，3個濃度的CNT(0.01、0.03、0.1 mg/mL)都不影響BMDCs表面CD86和MHCII的表達，CpG可顯著提高BMDCs表面MHCII的表達，使CD86的表達略有增加，但與對照組相比沒有顯著性差異。CNT/CpG復合物可以進一步促進BMDCs表面CD86和MHCII的表達，但與單獨CpG相比沒有顯著性差異(見圖3(a)、(b))。

進一步對碳納米管影響BMDCs釋放TNF-α的情況進行了分析。實驗結果發現，CNT(0.03 mg/mL)可略降低TNF-α的表達，但沒有顯著性差異；CpG刺激可顯著促進TNF-α的表達，CNT/CpG復合物可稍抑制TNF-α的表達，但不具有顯著性差異(見圖3(c))。這些結果提示，CNT不影響BMDCs的成熟和活化，也不干擾CpG引起的BMDCs的成熟和活化。

圖3 CNT對BMDCs成熟的影響。(a)不同處理因素對BMDCs表面CDMHCII平均熒光強度的影響;(b)不同處理因素對BMDCs表面CD86平均熒光強度的影響；(c)不同處理因素對BMDCs表達TNFα的影響(*P<0.05,**P<0.01 vs Con)Fig.3 The effect of CNT to BMDCs maturation. (a) Mean fluorescence intensity of MHCII； (b) Mean fluorescence intensity of MHCII expression on the surface of BMDCs after different treatment； (c) TNFα expression with different treatment (*P<0.05,**P<0.01 vs Con)

樹突狀細胞攝取抗原后，經過胞內途徑與MHCI或MHCII類分子結合，形成MHC-抗原復合物被轉運到細胞膜上，提呈給CD8+或CD4+T細胞。膜表面MHCI和II分子的表達是決定樹突狀細胞抗原提呈的關鍵分子。實驗結果顯示，低濃度的O-3/CNT抗原復合物(0.01 mg/mL)可促進MHCI類分子的表達；高濃度的CNT/抗原復合物處理后，BMDCs表達MHCI分子的水平降低。3個濃度的CNT/抗原復合物都提高BMDCs細胞表面MHCII類分子的表達，且具有CNT濃度依賴性，CNT濃度越高，復合物對MHCII表達的促進作用越明顯(見圖4)。

圖5 O-3/CNT復合物處理BMDCs對淋巴細胞功能的影響。(a)3個CNT濃度的O-3/CNT復合物處理的BMDCs對淋巴細胞IL-4、IL-13和IL-10表達的影響(*P<0.05，**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)3個CNT濃度的O-3/CNT復合物處理的BMDCs對CD4+T和CD8+T細胞增殖的影響Fig.5 Mix lymphocytes reaction induced by the mixture of O-3/CNT treated BMDCs.(a)IL-4, IL-13 and IL-10 expression of lymphocyte measured by ELISA kit (*P<0.05,**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)CD4+T and CD8+T cell proliferation.

圖4 O-3/CNT復合物對BMDCs細胞表面MHCI(a)和MHCII類分子(b)表達的影響Fig.4 The mixture of O-3/CNT antigen influences on the MHCI (a) and MHCII (b) expression of BMDCs

2.4 混合淋巴細胞反應

將O-3/CNT抗原復合物處理的BMDCs與同種小鼠脾淋巴細胞混合培養，分析淋巴細胞的細胞因子表達和增殖情況。實驗結果顯示，O-3/CNT復合物處理的BMDCs細胞可顯著降低Th2型細胞因子IL-4和IL-13的表達，對IL-10的表達略有影響(見圖5(a))。淋巴細胞增殖實驗結果顯示3個CNT濃度的抗原復合物處理的DCs降低了CD4+T淋巴細胞增殖，低CSFE表達的CD4+T的比例從對照組的54.4%降低到38.9%、46.6%和39.8%。與CD4+T細胞反應不同，O-3/CNT復合物處理DCs可以顯著促進CD8+T淋巴細胞增殖。特別是0.01和0.03 mg/mL的CNT，分別將低CSFE表達的CD8+T細胞比例從對照組的28.7%提高到40.6%和41.3%。但是，高濃度(0.1 mg/mL)O-3/CNT復合物處理的DCs對CD8+T細胞增殖的促進作用較弱(見5(b))。

3 討論

有研究表明，樹突狀細胞通過調節抗原與MHC類分子結合和釋放細胞因子，調控Th分化[17]。本研究發現，BMDCs可以大量吞噬碳納米管，其表面活化分子MHCII、CD86和TNF-α表達沒有明顯變化。有研究發現，功能化多壁碳納米管對骨髓來源的樹突細胞細胞表面活化標志物表達沒有影響，碳納米管對樹突狀細胞抗原遞呈作用的促進來源于其促進抗原的攝取[18]。通常OVA323-339抗原多肽被DCs攝取后，與MHCII分子結合，激活CD4細胞，抑制CD8細胞增殖，促進Th2分化。少量抗原-MHCII復合物可以通過“交叉呈遞”的方式，進入MHCI類抗原呈遞途徑，促進CD8+T增殖和Th1分化。碳納米管運載抗原在樹突狀細胞內的轉運過程與單獨抗原分子可能不同。碳納米管負載OVA323-339后，促進BMDCs表面MHCII分子的表達，抑制Th2型細胞因子的表達，促進CD8+T細胞的增殖。這提示碳納米管有可能促進OVA323-339抗原通過MHCII類分子途徑遞呈給CD8+T細胞，同時抑制Th2型細胞因子的表達。有研究發現，結核菌素-單壁碳納米管復合物可以促進免疫反應由Th2型向Th1型轉變，促進IFN-γ的表達[19]。氧化多壁碳納米管可以促進多肽特異性的CD8+T細胞的增殖，促進抗腫瘤免疫治療效果[20]。多壁碳納米管如何調控Th分化和抗原交叉遞呈的相關機制尚需進一步深入研究。

4 結論

BMDCs可以大量吞噬CNT，增加MHCII的表達，促進OVA323-339多肽抗原的呈遞和CD8+T淋巴細胞的增殖，抑制Th2型細胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表達，使免疫反應由Th2向Th1型轉變。CNT可以通過增加抗原的攝取和交叉提呈，促進細胞免疫響應，有望成為一種新型抗原載體。

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Carbon Nanotubes Influence Dendritic Cells Maturation and T Cell Polarization

Dai Yali Nie Xin Liu Jian#Meng Jie#*Xu Haiyan#*

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

Th differentiation play a key role in modulating immune response, which is mainly controlled by dendritic cells (DCs). Carbon nanotubes are unique nanomaterials composed of carbon element with hollow tube structures, which could be used as antigen carrier. The interaction of carbon nanotubes with DCs is key factor modulating following immune responses. This work studied the interaction between oxidized multiwalled carbon nanotubes (CNT) and DCs, and the mixture of CNT and allergic antigen peptide OVA323-339(O-3) on DCs and DCs-mediated Th1/Th2 responses. Our results showed that CNT was engulfed by DCs, and the expression of MHCII, CD86 and TNF-α of DCs was unchanged by CNT. The mixture of CNT/O-3 treated DCs induced increased CD8+T cell proliferation. The proliferation ratio of CD8+T cells increased from 28.7% of control to 40.6%, 41.3% and 29.6%. Th2 cytokines expression of IL-4, IL-10 and IL-13 was significantly inhibited. The proliferation ratio of CD4+T cells were decreased from 54.5% of control to 38.9%, 46.6%, and 39.8%. All the results indicated that CNT did not influence the maturation of DCs but promote Th1 polarization of T cells by inhibiting the Th2 cytokines expression of allergic peptide antigen.

dendritic cells; carbon nanotubes; Th polarization; anti-inflammatory cytokines; allergic antigen

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.011

2017-03-15， 錄用日期:2017-04-30

北京市自然基金(7162128)；協和青年基金(3332016136)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0464-06

# 中國生物醫學工程學會會員(Member, Chinese Society of Biomedicial Engineering)

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: mengjie@ibms.pumc.edu.cn； xuhy@pumc.edu.cn