Gab2對結腸癌細胞細胞外黏附作用的影響

劉玉輝, 孫慶慶, 郭 放

(沈陽軍區總醫院 腫瘤科, 遼寧 沈陽, 110006)

Gab2對結腸癌細胞細胞外黏附作用的影響

劉玉輝, 孫慶慶, 郭 放

(沈陽軍區總醫院 腫瘤科, 遼寧 沈陽, 110006)

; 目的 探討Gab2對結腸癌細胞外黏附作用的影響。方法 選取SW620和HCT116兩種結腸癌細胞系，建立Gab2 表達降低和Gab2 表達升高的穩定細胞株。將實驗NOD/SCID小鼠分為3組，每組10只。① 對照組; 接種scr/MGC803體結腸癌細胞; ② Gab2降低組; 接種Gab2降低的siGab2/MGC803結腸癌細胞; ③ Gab2升高組; 接種Gab2升高的Gab2/MGC803結腸癌細胞。檢測細胞遷移能力，測量腫瘤的大小和侵襲范圍及細胞凋亡情況。結果 處理后3組細胞遷移數計算結果顯示, Gab2降低組的細胞遷移數顯著低于Gab2升高組和對照組(P<0.05)。各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，比較接種前與接種后小鼠體質量, Gab2降低組顯著低于Gab2升高組、對照組，對照組低于Gab2升高組。測量瘤體積，Gab2升高組高于Gab2降低組、對照組。Gab2降低組瘤體積抑制率顯著高于對照組(P<0.05)。相關分析發現，MMP-2、MMP-9蛋白的表達與Gab2蛋白表達呈正相關。結論 Gab2可有效調控體外細胞遷移數，顯著抑制小鼠結腸癌細胞侵襲及轉移，通過調節MMP-2、MMP-9蛋白表達，從而抑制結腸癌生長及轉移。

結腸癌; Gab2; 細胞外黏附作用

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，其較高的侵襲能力和多耐藥性是目前的研究難點。作者擬通過細胞學實驗、免疫缺陷鼠注射實驗，圍繞結腸癌細胞的遷移、結腸癌細胞與細胞外基質的黏附、結腸癌對細胞外基質的降解這幾個影響結腸癌侵襲的機制，闡明Gab2在結腸癌侵襲過程中的重要作用及相關信號轉導通路，揭示Gab2與已知的結腸癌侵襲相關的信號分子的關系及相互作用機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

6～8周齡大的NOD/SCID小鼠，體質量22 g左右，由中山大學中山醫學院動物實驗中心動物房提供。人結腸癌細胞系SW620和HCT116引自中國科學院上海細胞生物學研究所, BCA試劑盒來源于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染與計數: 利用慢病毒載體小RNA干擾技術，建立Gab2 表達降低的穩定細胞株(Gab2降低組)，將野生型Gab2 cDNA序列轉染入結腸癌細胞，建立Gab2 表達升高的穩定細胞株(Gab2升高組)。將經過處理細胞和對照組細胞重懸于BM(RPMI 1640, 0.1 BSA, 25 mmol/L HEPES)中，使之最終濃度為0.5×106cell/mL。在趨化小室下層板中加入因子，每孔30 μL。上、下層板間加入一張濾膜(0.001%纖維連接蛋白，厚度8 μm, 4 ℃下包被過夜)，上層板中每孔加入細胞懸液50 μL, 放入孵箱內，設置溫度37 ℃, 5%CO2孵育3 h后取出，刮去濾膜上層細胞，洗滌后染色，在顯微鏡(400倍)下進行觀察。每孔取3個視野進行細胞計數。

1.2.2 SW620和HCT116細胞的體外遷移實驗: 消化、收集細胞, PBS洗1～2次，用含BSA的無血清培養基重懸[細胞密度(1～10)×105/mL]。取適量細胞懸液加入Transwell小室(按transwell說明), 200 μL 24孔板，下室加入含FBS的培養基500 μL, 加入過程中避免產生氣泡。將孔板常規培養24 h后，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，用0.1%結晶紫染色。顯微鏡進行觀察和拍照，取3～5個視野計數細胞個數。

1.2.3 動物實驗及細胞接種: 將NOD/SCID小鼠分為3組，每組10只，培養的細胞消化后按1×107個將對照MGC803細胞、Gab2表達降低或升高的MGC803細胞和Gab2表達升高的MGC803細胞接種在4周齡NOD/SCID小鼠的前胸壁皮下，分別命名為對照組、Gab2降低組和Gab2升高組。① 對照組; 接種scr/MGC803體結腸癌細胞; ② Gab2降低組; 接種Gab2降低的siGab2/MGC803結腸癌細胞; ③ Gab2升高組; 接種Gab2升高的Gab2/MGC803結腸癌細胞。觀察實驗NOD/SCID小鼠的一般狀態和生存時間，監測荷瘤NOD/SCID小鼠皮下內腫瘤生長和侵襲和轉移情況，并測量腫瘤的大小和侵襲范圍。各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，取鼠胸壁腫瘤組織和肺臟、肝臟、腎臟、腦組織、腎上腺，計數注射部位周邊的衛星結節數量和肺臟、肝臟、腎臟、腦組織、腎上腺內的轉移結節數量，檢測Gab2在體內實驗中對結腸癌的侵襲和轉移能力的影響。

1.2.4 Gab2與MMP的合成途徑: 細胞學實驗; 應用明膠酶譜和Western Blotting分別檢測結腸癌細胞分泌基質金屬蛋白酶的量和活性。動物實驗: NOD/SCID小鼠移植瘤切片進行Gab2及MMP-2和MMP-9的免疫組化檢測，判斷Gab2的表達與基質金屬蛋白酶合成的相關性。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各實驗組發生遷移細胞數統計結果

處理后3組細胞(400倍顯微鏡視野下)遷移數計算結果, Gab2降低組的細胞遷移數(45.09±8.93)個，顯著低于Gab2升高組(278.93±11.08)個和對照組(104.28±7.82)個, 3組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.2 監測荷瘤NOD/SCID小鼠皮下內腫瘤生長和侵襲和轉移情況

各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，比較接種前與接種后小鼠體質量, Gab2降低組顯著低于Gab2升高組、對照組，對照組低于Gab2升高組。測量瘤體積, Gab2升高組高于Gab2降低組、對照組。Gab2降低組瘤體積抑制率顯著高于對照組(P<0.05), 見表1。

表1 治療后2組療效評價

與Gab2降低組相比, *P<0.05; 與對照組相比, #P<0.05。

2.3 轉染后Gab2與MMP-2、MMP-9表達的關系

轉染后, Gab2表達率較高的組織中MMP-2、MMP-9蛋白陽性率高, Gab2蛋白表達較低的組織中, MMP-2、MMP-9蛋白陽性率低，根據相關分析發現, MMP-2、MMP-9蛋白的表達與Gab2蛋白表達呈正相關，見表2。

表2 轉染后Gab2與MMP-2、MMP-9表達的關系

3 討 論

近年來，結腸癌的發病率和致死率逐年遞增，中國結直腸惡性腫瘤發病率位居第4位[1]。研究[2]發現，在眾多的細胞信號轉導通路中, Gab2均發揮著重要的傳導作用，與部分癌癥、糖尿病及心腦血管疾病有關，其中以影響惡性腫瘤細胞信號傳導通路為主，在乳腺癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤組組織中高度表達。研究[3]顯示, Gab2的表達水平與腫瘤的淋巴結轉移通路相關，直接影響患者預后及生存期。

結腸癌細胞具備趨化運動，是結腸癌細胞侵襲、轉移的關鍵，也是結腸癌細胞侵襲的主要因素[4]。本研究證實, Gab2參與了結腸癌的趨化運動相關的信號通路, Gab2降低組腫瘤細胞趨化數量顯著降低。研究[5]表明, Gab2可能通過影響actin的聚合與解聚合的循環參與了結腸癌細胞的遷移。結腸癌細胞與周圍細胞外基質的黏附能力的增加是造成結腸癌細胞侵襲和轉移的重要機制。本研究發現, Gab2降低組的小鼠體質量與瘤體積顯著低于Gab2升高組及對照組, Gab2升高對于癌細胞抑制率顯著升高。進一步證實Gab2參與了細胞外基質、結腸癌細胞的黏附過程，使結腸癌細胞可以轉移、侵襲。

結腸癌細胞轉移包括黏附、降解以及移動。細胞外基質(ECM)是阻止腫瘤細胞轉移的重要屏障, ECM降解酶則會導致ECM的降解，使ECM失去屏障作用。其中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是ECM降解酶中的重要成分，能降解膠原、明膠、纖維黏連蛋白以及層粘連蛋白等，在腫瘤細胞浸潤、轉移的過程中扮演著重要角色。而在多數惡性腫瘤中發現MMP-2有著過度表達[6]。金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)可有效抑制MMP-2的活性，是MMP-2的特異性抑制劑，可發揮抗腫瘤轉移、浸潤的作用[2]。因此MMP-2與TIMP-2的平衡關系與腫瘤血管化過程有重要關系[7]。由于ECM是抑制腫瘤轉移、侵襲的屏障，因此觀察ECM水平可有效預測腫瘤細胞的侵襲性及轉移能力[8]。本研究證實，細胞轉染后, Gab2表達率較高的組織中MMP-2、MMP-9蛋白陽性率高, Gab2蛋白表達較低的組織中, MMP-2、MMP-9蛋白陽性率低，根據相關分析發現, MMP-2、MMP-9蛋白的表達與Gab2蛋白表達成正相關。

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Effect of Gab2 on extracellular adhesion of colon cancer cells

LIU Yuhui, SUN Qingqing, GUO Fang

(Department of Oncology, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang, Liaoning, 110006)

Objective To investigate the effect of Gab2 on extracellular adhesion of colon cancer cells. Methods SW620 and HCT116 were selected to establish the stable cell lines of Gab2 high expression and Gab2 low expression in two colon carcinoma cell lines. The experiment NOD/SCID mice were divided into 3 groups, 10 rats in each group. The control group included scr/MGC803 inoculation of colon cancer cells, Gab2 reduction group included Gab2 colon cancer cells with reduced inoculation of siGab2/MGC803, and elevated Gab2 group included Gab2/MGC803 colon cancer cells with elevated Gab2 inoculation. Cell migration, tumor size, invasion and cell apoptosis were observed. Results After the treatment, cells transference number calculation results showed that cell migration in GAB2 reduced group was significantly lower than that in GAB2 increased group and control group (P<0.05). NOD/SCID mice were sacrificed 40 days after inoculation, in the comparison of weight of mice before and after inoculation, the Gab2 decreased group was significantly lower than the Gab2 increased group and the control group, and the control group was significantly lower than the Gab2 increased group. In comparison of tumor volume, Gab2 increased group were significantly higher than the Gab2 decreased group and the control group. In Gab2 decreased group, tumor volume inhibition rate was significantly higher than the control group (P<0.05). The correlation analysis showed that MMP-2 and MMP-9 protein expression were positively correlated with GAB2 protein expression. Conclusion Gab2 can effectively regulate the number of cell migration in vitro, significantly inhibit the invasion and metastasis of colon cancer cells in mice, and inhibit the growth and metastasis of colon cancer by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9 protein.

colon cancer; Gab2; extracellular adhesion

2017-01-16

遼寧省科學技術廳項目(2015020408)

R 735.3

A

1672-2353(2017)15-061-03

10.7619/jcmp.201715016