羥基自由基氧化對牛血清白蛋白結構及水合特性的影響

王策，李俠，鄧少穎，王航，張春暉

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羥基自由基氧化對牛血清白蛋白結構及水合特性的影響

王策，李俠，鄧少穎，王航，張春暉

（中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京100193）

【目的】研究羥基自由基（·OH）氧化對蛋白結構及其水合特性的影響，探討氧化介導的關于蛋白質和水分相互作用的變化情況?！痉椒ā繉⑴Ｑ灏椎鞍祝╞ovine serum albumin，BSA）溶解在含15 mmol·L-1的PIPES緩沖溶液中（pH 6.0），并在不同濃度H2O2（0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol·L-1）的鐵-抗壞血酸-過氧化氫（FeCl3-Vc-H2O2）羥基自由基氧化體系孵育12 h，采用氨基酸自動分析儀分析BSA不同程度氧化的氨基酸含量變化；通過測定羰基含量、巰基含量分析蛋白的氧化程度；通過測定BSA表面疏水性、離子鍵、氫鍵，考察BSA氧化不同程度后水合能力的變化情況；通過測定Zeta電位值來分析蛋白氧化后表面電荷的變化；采用傅里葉紅外光譜法分析蛋白二級結構的變化?！窘Y果】隨著羥基自由基氧化體系中H2O2濃度的增加，氨基酸含量呈下降趨勢，但不同種類氨基酸對·OH氧化敏感性不同，在1 mmol·L-1H2O2處理濃度下，蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）含量顯著降低，較對照組（未經H2O2處理組）分別下降了4.30%、4.22%；當H2O2濃度升高到20 mmol·L-1時，較對照組蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）這3類氨基酸的含量下降程度最大，分別為35.32%、19.19%、11.15%，其次為異亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）、半胱氨酸（Cys）。隨H2O2濃度的增加，BSA的羰基含量顯著增加（＜0.05），20 mmol·L-1H2O2處理組比對照組羰基含量升高了57.52%；巰基含量顯著降低（＜0.05），20 mmol·L-1H2O2處理組比對照組巰基含量降低了74.04%，蛋白氧化程度顯著加??；BSA經氧化處理后，蛋白二級結構發生變化，α-螺旋、無規卷曲含量顯著降低（＜0.05），β-折疊、β-轉角含量顯著增加（＜0.05），多肽鏈中α-螺旋結構伸展變成線性結構，蛋白表面疏水性隨著氧化程度的加劇而顯著增加（＜0.05），蛋白持水力降低；同時氧化作用降低了蛋白表面的凈電荷數，Zeta電位的絕對值隨著羥基自由基氧化體系中H2O2濃度的增加而顯著降低（＜0.05），離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，降低了蛋白-水分子相互作用力，蛋白持水力降低?！窘Y論】BSA在羥基自由基氧化體系中，存在顯著的濃度效應，隨著氧化程度加劇，蛋白表面的凈電荷顯著降低，離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，蛋白二級結構發生了變化，蛋白-水分子相互作用力降低。

牛血清白蛋白；羥基自由基氧化體系；蛋白結構；水合特性

0 引言

【研究意義】蛋白質很多功能性質，如溶解性、乳化性和凝膠特性等都取決于蛋白質和水的相互作用[1]。水分子通過與蛋白中的帶電基團（離子-偶極相互作用）、酰胺基團（偶極-偶極相互作用）、羥基（偶極-偶極相互作用）等進行相互作用。蛋白質氧化是食品領域研究的熱點課題，蛋白質在自由基或其他氧化物的作用下，氨基酸殘基發生氧化效應，改變了其質子化程度，使得蛋白帶電基團發生改變，進而改變蛋白表面的凈電荷，影響蛋白持水力。另一方面，氧化導致蛋白主鏈及氨基酸殘基側鏈發生改變，如肽鏈的斷裂、氨基酸殘基側鏈的氧化修飾、蛋白交聯聚合等[2-3]，使其一級、二級及高級結構發生變化，導致溶液中蛋白表面疏水殘基和親水殘基的改變，從而影響蛋白與水的互作關系。因此，開展蛋白氧化基礎理論研究，探索氧化效應對牛血清白蛋白水合特性的影響具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】對蛋白氧化的研究大多以肉蛋白、乳蛋白等為研究對象，且取得一定進展。PARK等[4-5]研究了3種氧化模擬體系中豬肉肌原纖維蛋白的變化，發現肌原纖維蛋白經不同程度氧化后，其羰基含量增加，蛋白的熱穩定性下降以及蛋白交聯聚合等。李銀等[6]研究發現肌原纖維蛋白在羥基自由基氧化體系中，氨基酸含量下降，蛋白結構發生變化，蛋白持水力降低。HARRIS等[7]研究發現蛋白氧化能顯著改變蛋白質的空間效應，從而影響肌肉的持水性。血清蛋白是動物體血漿中含量較為豐富的一種蛋白質，其分子量小、結構穩定、溶解度大，連接氨基殘基的共價鍵有肽鍵及由兩個半胱氨酸殘基的側鏈形成的二硫鍵，它可以使兩條單獨的肽鏈通過共價鍵交聯[8-9]。大量文獻表明，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是研究蛋白理化性質的理想模型[10-11]。目前關于BSA氧化的研究主要集中在生化研究等方面，程伶俐等[12]在研究牛血清白蛋白的光損傷和光氧化機理時發現SO4-·自由基是通過與BSA中的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）發生電子轉移反應來氧化BSA的。IONITA等[13]研究發現加入環糊精能夠降低肼基自由基對BSA的氧化速率。ALEGRIA等[14]在研究環木質素醌對BSA的巰基氧化和其與BSA的共價結合時發現，在有MgCl2存在的情況下可以使環木質素醌介導的BSA的巰基氧化和共價結合作用增強。而以BSA為研究對象，研究其在羥基自由基氧化體系中的氧化機制卻未見報道。【本研究切入點】目前，國內外關于蛋白氧化的研究大多集中在蛋白表觀指標變化方面以及氧化對蛋白凝膠形成的影響。蛋白的氧化反應是一個電子轉移過程，改變了蛋白的表面電荷狀態，進而影響了蛋白中的帶電基團與水分子之間的互作關系，常見食品體系復雜多樣，為探討和揭示蛋白氧化過程中電子轉移機制而避免離子強度、pH等其他因素的干擾，本試驗首先選擇純蛋白體系BSA為研究對象。【擬解決的關鍵問題】通過分析BSA在鐵-抗壞血酸-過氧化氫（FeCl3-Vc-H2O2）羥基自由基氧化體系中，不同氧化程度條件下蛋白氨基酸殘基、羰基含量、巰基含量、表面疏水性、Zeta電位值、蛋白二級結構及分子間作用力等指標變化，研究蛋白氧化過程中結構及水合特性的變化情況，探討蛋白結構與蛋白水合特性之間的內在關系，為進一步揭示氧化對蛋白持水力的影響機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2015年6—12月在中國農業科學院農產品加工研究所肉品實驗室和農業部農產品加工綜合性重點實驗室進行。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、哌嗪-N,N'-雙（2-乙磺酸）（piperazine- 1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）（美國Sigma公司），5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-Dithio bis-(2- nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鹽酸胍、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane，Tris）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、尿素、溴酚藍（Bromophenol blue，BPB）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2.2 主要儀器設備 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），TXF200-S12 恒溫循環水浴鍋（英國 Grant公司），T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），L-8900 氨基酸自動分析儀（日本日立公司），Zeta電位分析儀（英國Malvern公司），X-12R高速冷凍離心機（美國Beckman公司），傅里葉變換紅外光譜儀（德國Buruker公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 FeCl3/Vc/H2O2（鐵/抗壞血酸/過氧化氫）氧化體系構建 參考PARK等[15]方法構建以下氧化體系：反應歷程為Vc+Fe3+→Fe2+，Fe2++H2O2→·OH，FeCl3濃度為0.01 mmol·L-1，Vc濃度為0.1 mmol·L-1，H2O2濃度分別為0（對照組）、0.5、1、5、10和20 mmol·L-1。牛血清白蛋白分散于上述氧化體系中（終質量濃度為40 mg·mL-1），在4℃條件下密封氧化12 h后用EDTA（終濃度為1 mmol·L-1）終止反應。以上氧化反應均在15 mmol·L-1PIPES緩沖溶液（pH 6.0）中進行。

1.3.2 氨基酸分析 取1 mL氧化的BSA溶液，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，充氮1 min排出管內空氣并封口，水解管置于110℃的恒溫箱內水解24 h后冷卻至室溫，過濾，并將濾液定容到50 mL容量瓶中。取1 mL液體氮吹，直到吹干后再加入5 mL 0.02 mol·L-1的鹽酸復溶。混勻后過0.2 μm膜，用氨基酸自動分析儀測定氨基酸[6]。

1.3.3 羰基含量的測定 參考LEVINE等[16]方法測定羰基值。將氧化后的BSA濃度調整為2 mg·mL-1。取0.1 mL稀釋后的蛋白溶液，然后加入0.5 mL含2,4-二硝基苯肼的2 mol·L-1HCl溶液，空白樣品中加入0.5 mL不含2,4-二硝基苯肼的2 mol·L-1HCl溶液，在25℃下反應40 min。然后再加入0.5 mL 20%的三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），震蕩后離心（11 000×，5 min）棄去上清，用體積比為1﹕1的乙醇-乙酸乙酯溶液洗滌沉淀3次，揮發完溶劑后將蛋白質懸浮于1 mL 6 mol·L-1鹽酸胍溶液中，在37℃條件下水浴保溫30 min。以空白為對照并于370 nm下測吸光值，蛋白質羰基衍生物的含量（nmol·mg-1蛋白）使用摩爾吸光系數22 000 M-1cm-1計算。

1.3.4 巰基含量的測定 總巰基含量的測定參考ELLMAN等[17]方法。將氧化后的BSA濃度調整為2 mg·mL-1。取1 mL稀釋后的蛋白溶液，然后加入1 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液（pH 8.3）（含有6 mol·L-1鹽酸胍、1 mmol·L-1EDTA）與10 μL 100 mmol·L-1Tris-HCl 溶液（pH 7.6）（含有10 mmol·L-1DTNB）混勻，在25℃下靜置25 min，并于412 nm下測定其吸光值，巰基含量（nmol·mg-1蛋白）使用摩爾吸光系數13 600 M-1cm-1計算。

1.3.5 傅里葉紅外分析 采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）分析BSA氧化后二級結構的變化。參照GANGIDI等[18]方法，并略作修改。采用多次衰減全反射技術（Attenuated total re?ection，ATR）進行測量，取適量氧化后的BSA溶液放于ATR附件上掃描，紅外譜圖記錄采用OMNIC軟件，測定范圍4 000—400 cm-1，掃描次數100次，掃描速率0.63 cm·s-1，分辨率4 cm-1。紅外光譜的數據處理采用PeakFit 4.12軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。

1.3.6 表面疏水性 用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液將氧化的BSA濃度調整為2 mg·mL-1，取2 mL蛋白溶液并加入40 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍溶液，空白為2 mL磷酸鹽緩沖液加入40 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍溶液，渦旋振蕩混勻10 min后離心（4℃，4 000×，15 min），取上清液于595 nm測定吸光值[19]。用結合態的疏水溴酚藍結合量（總溴酚藍與游離溴酚藍的差值）作為表面疏水性指數。

=40×

式中，為表面疏水性（μg）；control為空白的吸光度值；sample為樣品的吸光度值。

1.3.7 Zeta電位的測定 參考劉澤龍[20]的方法測定Zeta電位值，并略作修改。用15 mmol·L-1PIPES緩沖溶液（pH 6.0）將氧化的BSA濃度調整為1 mg·mL-1。使用馬爾文NanoZS型粒度儀中的SOP模式測定Zeta電位（mV）。

1.3.8 離子鍵、氫鍵的測定 參照Gómez-Guillén等[21]方法測定離子鍵和氫鍵含量，并略作修改。取2 mL經氧化的BSA溶液分別與10 mL 0.05 mol·L-1NaCl（S1）、0.6 mol·L-1NaCl（S2）、0.6mol·L-1NaCl + 1.5 mol·L-1尿素（S3）混合均勻，4℃靜置1 h后離心（10 000×，15 min，4℃）。按照雙縮脲測定蛋白含量的方法測定各上清液的吸光值。離子鍵含量用S2溶液和S1溶液的吸光值之差來表示，氫鍵含量用 S3溶液和S2溶液的吸光值之差來表示。

1.4 數據分析

采用SAS9.2軟件進行方差分析，不同處理間差異采用Duncan多重比較，顯著水平為＜0.05，上述試驗如未特殊說明均最少為6次平行并進行了3次重復，結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果

2.1 H2O2濃度對BSA氨基酸殘基含量的影響

H2O2濃度對BSA氨基酸含量的影響如表1所示。隨著H2O2濃度的提高，所有氨基酸殘基含量基本呈下降趨勢，但不同氨基酸對羥基自由基的敏感性不同。在H2O2濃度為1 mmol·L-1時，蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）含量表現出顯著下降（＜0.05），較對照組分別下降了4.30%、4.22%，表明這兩類氨基酸對羥基自由基體系下的氧化效應最為敏感。隨著H2O2濃度的升高，各類氨基酸含量下降程度不同，當H2O2濃度升高到20 mmol·L-1時，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）和組氨酸（His）下降程度最大，分別為35.32%、19.19%和11.15%；其次為異亮氨酸（Ile），甘氨酸（Gly）和半胱氨酸（Cys），分別下降了10.62%、10.60%和10.35%。

2.2 H2O2濃度對BSA羰基、巰基含量的影響

由圖1-a可知，對照組中BSA的羰基含量為0.46 nmol·mg-1蛋白，當H2O2濃度為1 mmol·L-1時，羰基含量開始顯著增加（＜0.05），當H2O2濃度升高到20 mmol·L-1，羰基含量為0.72 nmol·mg-1蛋白，較對照組增加了57.52%，表明蛋白氧化程度顯著加劇。由圖1-b可知，對照組中BSA的巰基含量為76.47 nmol·mg-1蛋白，隨著H2O2濃度的增加，巰基含量呈顯著下降趨勢，在低濃度的H2O2條件下，巰基含量下降程度較低。當H2O2濃度為5 mmol·L-1時，巰基含量為32.72 nmol·mg-1蛋白，較對照組降低57.21%；當H2O2濃度升高到20 mmol·L-1，巰基含量為19.85 nmol·mg-1，較對照組降低74.04%。

2.3 H2O2濃度對BSA二級結構的影響

采用FTIR分析蛋白氧化過程中二級結構的變化規律，BSA在紅外區有明顯的特征光譜吸收帶，其中酰胺I帶（1 600—1 700 cm-1）主要是由C=O的伸縮振動引起，此外C–N的伸縮振動也起部分作用，酰胺I帶能非常敏感地反映出蛋白質中的二級結構變化[22-23]。圖2為BSA的酰胺I帶FTIR光譜圖，與對照組相比，經不同濃度H2O2氧化后，該譜帶半峰寬、強度及峰位有一定程度的變化，表明BSA的二級結構發生了改變。采用傅里葉自退卷積、二階導數及曲線擬合等技術對BSA的酰胺I帶進行處理，蛋白質二級結構的譜峰指認如下：1 646—1 661 cm-1為α-螺旋結構，1 615—1 637 cm-1和1 682—1 698 cm-1為β折疊結構，1 661—1 681 cm-1為β轉角結構，1 637—1 645 cm-1為無規卷曲結構[24]。

表1 H2O2濃度對氨基酸含量的影響

同行不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同 Values with different letters in the same row indicate significant difference (＜0.05). The same as below

不同字母表示差異達5%顯著水平。下同 Values in a column followed by different letters are significant differ (P＜0.05). The same as below

H2O2濃度對BSA二級結構相對含量的影響如表2所示。隨著H2O2處理濃度的升高，α-螺旋含量下降，當H2O2處理濃度升高到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1時，α-螺旋含量分別下降了11.16 %和21.63%；H2O2處理濃度在0—1 mmol·L-1時，β-折疊含量與對照組相比無顯著差異（＞0.05），在5—20 mmol·L-1時，β折疊含量出現了顯著增加（＜0.05），增幅為15.46 %—21.97 %；β-轉角含量隨著H2O2濃度的升高而顯著增加（＜0.05），并存在·OH濃度效應；無規卷曲含量在H2O2濃度為0—1 mmol·L-1時基本保持不變，當H2O2濃度升高到5—20 mmol·L-1時含量顯著降低（＜0.05）。

2.4 H2O2濃度對BSA表面疏水性影響

羥基自由基氧化體系中H2O2濃度對BSA表面疏水性的影響如圖3所示，對照組BSA吸附溴酚藍（BPB）的量為13.39 μg，0.5 mmol·L-1H2O2處理組BSA的表面疏水性與對照組無顯著差異（＞0.05）；隨著H2O2處理濃度的升高，表面疏水性較對照組顯著增加（＜0.05），當H2O2濃度為1 、5、10和20 mmol·L-1時，BSA吸附溴酚藍的量分別為14.30 μg、15.73 μg、16.07 μg和16.46 μg。

2.5 H2O2濃度對BSA的Zeta電位影響

圖4為羥基自由基氧化體系條件下BSA中Zeta電位隨H2O2濃度的變化情況。隨著H2O2濃度的升高，Zeta電位的絕對值顯著降低（＜0.05）；對照組BSA的Zeta電位值為-8.61 mV，在0.5—5 mmol·L-1H2O2氧化條件下，Zeta電位的絕對值降低緩慢；當H2O2處理濃度升高到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1時，BSA的Zeta電位值分別為-7.34、-7.04 mV，電位的絕對值較對照組分別降低了14.75%、18.23 %。

圖3 H2O2濃度對表面疏水性的影響

圖4 H2O2濃度對Zeta電位的影響

表2 H2O2濃度對二級結構含量的影響

2.6 H2O2濃度對BSA分子間作用力的影響

不同H2O2濃度氧化條件下BSA中離子鍵、氫鍵變化情況如圖5-a、5-b所示。由圖5-a可知，對照組中BSA的離子鍵含量為0.25，0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1H2O2處理組離子鍵含量與對照組相比無顯著差異（＞0.05）；5、10和20 mmol·L-1H2O2處理組離子鍵含量分別為0.16、0.12、0.10，均較對照組顯著降低（＜0.05）。由圖5-b可知對照組的氫鍵含量為0.37，當H2O2濃度為0.5 mmol·L-1時，BSA中的氫鍵含量與對照組相比無顯著差異（＞0.05）；當H2O2濃度為1、5、10和20 mmol·L-1時，各處理組氫鍵含量分別為0.30、0.27、0.21、0.19，較對照組顯著降低（＜0.05）。表明受氧化影響，BSA溶液中離子鍵和氫鍵逐漸斷裂。

圖5 H2O2濃度對離子鍵（A）、氫鍵（B）的影響

3 討論

自由基介導的蛋白質氧化致使多肽鏈氧化斷裂和蛋白質側鏈氨基酸發生氧化修飾。在活性氧（ROS）的作用下，會引起蛋白質某些特定的氨基酸殘基發生反應，如羰基化合物的形成，巰基基團的損失，各類交聯物的形成等[25]，從而導致蛋白質的結構發生變化。然而蛋白氧化是與脂肪氧化相類似的自由基鏈式反應，其實質是一個電子轉移過程。蛋白質氧化能夠引起電子轉移，改變蛋白的表面特性，最終改變蛋白帶電基團與水分子間的相互作用[20]。

蛋白氧化導致的氧化損傷，首先涉及的是氨基酸殘基的破壞或修飾作用。理論上，所有的氨基酸側鏈都有可能被自由基氧化，但是許多學者指出，由于半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）含有易被ROS攻擊的活性基團，因此其為氧化反應中的敏感氨基酸[26]。其中蛋氨酸（Met）是必需氨基酸中唯一含硫的氨基酸，極易被氧化形成蛋氨酸亞砜衍生物；酪氨酸（Tyr）含有芳香環，·OH可氧化其生成二酪氨酸，半胱氨酸（Cys）含有巰基，極易被氧化形成二硫鍵[6]。然而，不同的氧化體系和蛋白質類型也會導致敏感氨基酸類型和氧化程度的不同[5]。AMICI等[27]指出，在金屬離子催化的氧化系統中，組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）都是容易被氧化的氨基酸。ELIAS等[28]認為，β-乳球蛋白中的半胱氨酸（Cys）比色氨酸（Trp）更易受氧化損傷，而蛋氨酸（Met）卻具有一定的抗氧化特性。BSA在266 nm激光作用下，BSA中的色氨酸（Trp）殘基首先以脫電子和發生分子內電子能級躍遷的形式受到破壞，進而通過分子內電子轉移的形式氧化酪氨酸（Tyr）殘基，最終其光損傷以這兩種氨基酸自由基的形式表達出來[12]。本研究發現，隨著氧化體系中H2O2濃度的升高，BSA中氨基酸殘基遭受自由基攻擊的程度加劇。其中，在低濃度 H2O2處理條件下，蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）為氧化敏感氨基酸；而在高濃度H2O2條件下，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、和組氨酸（His）的含量下降程度最大，然后依次為異亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）和組氨酸（Cys）。而李銀等[6]指出半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）是肌原纖維蛋白中在研究羥基自由基體系條件下的氧化敏感氨基酸。同樣的，PARK等[29]在研究肉蛋白中氨基酸的氧化情況時也得出了類似結論。這證實了不同的蛋白類型和氧化體系導致氨基酸敏感程度的差異較大，推測可能是由于不同蛋白質中氨基酸殘基的暴露程度不同[28]或蛋白結構的差異導致了其抗氧化能力的不同。羰基的形成（醛基和酮基）以及巰基的減少被廣泛用來評價蛋白的氧化程度[30]。帶有NH-或NH2-的氨基酸殘基側鏈與肽鏈骨架，易受自由基氧化攻擊，斷裂生成羰基衍生物，蛋白質中羰基含量越高表明蛋白的氧化程度越高[31]。巰基和二硫鍵是維系蛋白分子構象的重要化學鍵，對于穩定BSA完整的空間結構具有重要作用，BSA分子由581個氨基酸殘基組成，其中含有35個半胱氨酸，在肽鏈的第34位有一自由巰基[9]。巰基是蛋白質中最具反應活性的基團，在氧化過程中可發生可逆或不可逆反應，生成二硫鍵、次磺酸、亞磺酸和磺酸[32]。在MgCl2和鄰醌同時存在的情況下，BSA巰基的被氧化程度變得更大[14]。本研究發現BSA在羥基自由基氧化體系中，隨著H2O2濃度的升高，羰基含量顯著增加（＜0.05），巰基含量顯著降低（＜0.05）。崔旭海[33]、孫妍[34]等在研究自由基氧化體系下乳清蛋白和β-乳球蛋白的理化變化時發現，目標蛋白的巰基含量下降，羰基含量呈增加的趨勢。姜晴晴等[35]在研究羥基自由基氧化體系對帶魚蛋白理化性質的影響時指出，隨著氧化時間的延長，蛋白羰基含量顯著增加（＜0.05），而巰基含量表現為先增加后減少，推測可能是在短時間的氧化條件下肌原纖維蛋白的結構發生變化，導致更多的巰基基團暴露，而隨著氧化時間的延長巰基被氧化，含量隨之降低。

蛋白質氨基酸殘基的疏水性是評價蛋白質水合特性的一個重要指標，蛋白質表面疏水性反映了與外界極性水環境相連的蛋白質表面疏水性基團的數量，亦可用來衡量蛋白質的變性程度，蛋白表面疏水性越高，其結合水分的能力就越弱，變性程度越大[36]。氧化會導致蛋白的構象發生變化，隨著氧化程度的增加其結構逐漸展開，包裹在分子內部的一些疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸側鏈基團逐漸暴露，導致溶液中極性與非極性基團數量的改變，蛋白表面疏水性增加[23]。本研究同時發現，α-螺旋結構含量下降，β-折疊和β轉角結構含量增加，證明氧化確實導致了BSA二級結構的改變。李艷青[37]在研究鯉魚肌原纖維蛋白經自由基氧化后表面疏水性的變化情況時發現，整個氧化期間蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的升高、氧化時間的延長而不斷增加（＜0.05）；相同H2O2濃度，蛋白表面疏水性隨著氧化時間的延長而增加。李學鵬等[38]在研究羥基自由基氧化對草魚肌原纖維蛋白的表面疏水性影響時發現，草魚肌原纖維蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的升高而逐漸增大。本研究發現隨著氧化程度的加劇，蛋白表面疏水性顯著增加, 這與SUN等[39]研究蛋白氧化導致蛋白表面疏水性增加結果一致。此外，表面疏水性的氧化依賴性增加與蛋氨酸亞砜和二酪氨酸的含量增加也是相關的[40]。

蛋白粒子表面存在的凈電荷影響其界面周圍的離子分布形成雙電層[41]。Zeta電位是評價帶電微粒表面電荷的特性表征參數，可反映出體系中帶電粒子表面電荷的狀態，粒子表面電荷基團的微小變化將引起 Zeta電位的改變[42]。Zeta電位同時也是表征溶液穩定性的重要指標，Zeta電位絕對值越大，體系越穩定；反之穩定性下降，溶液會出現凝結和聚集現象[43]。本研究結果表明隨著氧化程度的加劇，BSA溶液的Zeta電位絕對值表現出顯著降低，表明隨著氧化程度的加深，BSA溶液氧化體系趨向于不穩定。蛋白質表面氨基酸所帶電荷的多少和電荷的正負性影響著蛋白質表面電位，從而影響了蛋白質溶液的Zeta電位值。一般說來，蛋白質表面帶正電荷的氨基酸多于帶負電荷氨基酸，其蛋白溶液Zeta電位為正值；反之，蛋白質表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷氨基酸，其蛋白溶液Zeta電位為負值[44]。葉林[45]在研究蛋白質氧化對花生蛋白乳液電位的影響時發現新鮮乳液的電位絕對值隨著氧化程度的增加主要呈減小趨勢，吳偉等[46]在研究過氧自由基氧化對大米蛋白Zeta電位的影響時發現，隨著過氧自由基濃度的增加，大米蛋白Zeta電位絕對值顯著下降（＜0.05）。本研究發現BSA經氧化后Zeta電位的絕對值表現出顯著降低（＜0.05），這與葉林[45]和吳偉[46]等的研究結論是一致的，推測可能是氨基酸含量發生改變以及氨基酸殘基側鏈發生的羰基化反應，改變了蛋白表面的質子化程度，其表面凈電荷隨著氧化程度的加劇而減少，蛋白的極性降低，蛋白的持水能力降低。此外，蛋白氧化后表面凈電荷的改變使得蛋白等電點發生偏移，亦會影響蛋白的持水能力[45]。α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲是蛋白質中主要的二級結構[47]。氫鍵、范德華力以及疏水作用和離子鍵等對維持蛋白結構穩定以及蛋白與水的互作關系起到非常重要的作用[48]，而靜電作用形成的氫鍵在蛋白質的二級結構中起著穩定構象的重要作用。本研究結果表明氧化使BSA多肽鏈中的α-螺旋結構不斷伸展而變成線性結構，β-折疊、β-轉角含量顯著增加（＜0.05）。推測可能是由于自由基的攻擊使分子內部氫鍵的排列取向發生改變，維持蛋白α螺旋結構的氫鍵斷裂，各種分子內和分子間相互作用力的平衡被打破，蛋白質各部分的空間排列發生改變。這與本試驗觀察到的氫鍵含量隨氧化程度增強而降低的結果相一致。

4 結論

氨基酸總含量隨H2O2濃度增加呈下降趨勢，其中蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）為低濃度H2O2條件下牛血清白蛋白（BSA）中的敏感氨基酸，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）和組氨酸（His）為高濃度H2O2條件下BSA中的敏感氨基酸。隨著H2O2處理濃度的升高，蛋白羰基含量顯著升高、巰基含量顯著降低；BSA經氧化處理后，蛋白二級結構發生變化，α-螺旋、無規卷曲含量降低，多肽鏈中α-螺旋結構伸展變成線性結構，β-折疊、β-轉角含量增加，同時蛋白表面疏水性增加，蛋白持水力降低。氧化作用改變了蛋白的表面電荷狀態，Zeta電位絕對值顯著下降，蛋白表面的電荷數降低，離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，降低了蛋白-水分子相互作用力。

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（責任編輯 趙伶俐）

Effects of Hydroxyl Radicals Oxidation on Structure and Hydration Properties of Bovine Serum Albumin

WANG Ce, LI Xia, DENG ShaoYing, WANG Hang, ZHANG ChunHui

(Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Comprehensive Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】The effects of oxidation on protein structure and its hydration properties were investigated. The purpose of this study was to explore the changes in protein and water interactions mediated by oxidation.【Method】Ferric ion-ascorbic acid-hydrogen peroxide (FeCl3-Vc-H2O2) hydroxyl radical oxidation system was used in this study. Bovine Serum Albumin (BSA) was suspended in 15 mmol·L-1piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid (PIPES) buffer (pH 6.0) and incubated at 4℃ for 12 h with ferric ion (Fe3+) and ascorbic acid (Vc) at different concentrations of hydrogen peroxide (0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, and 20.0 mmol·L-1H2O2). Amino acid content was measured by automatic amino acid analyzer. Carbonyl content and sulfhydryl content were detected to evaluate the degree of proteins oxidation. The changes of hydratability of BSA was evaluated by measuring the surface hydrophobicity, the content of ionic bond and the content of hydrogen bond. Electrochemical change rule under different oxidation levels was studied by measuring Zeta potential. In addition, the protein secondary structure was analyzed by Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy. 【Result】The content of amino acids in BSA declined with the increasing H2O2concentration. However, the selective effects of ·OH on amino acids were observed. Compared to the control group (0 H2O2treatment) , threonine (Thr) and lysine (Lys) decreased significantly by 4.30% and 4.22%, respectively, at 1 mmol·L-1of the H2O2concentration. When the concentration of H2O2increased to 20 mmol·L-1, the contents of methionine (Met), tyrosine (Tyr) and histidine (His) showed the highest reduction, which was reduced by 35.32%, 19.19% and 11.15%, respectively. Then the content of leucine (Ile), glycine (Gly) and cysteine (Cys) also showed their higher reduction. It was observed that the carbonyl content increased significantly (＜0.05) with increasing H2O2concentration, while sulfhydryl content significantly declined (＜0.05), i.e. Carbonyl content in 20 mmol·L-1H2O2treatment group (0.723 nmol·mg-1protein) increased by 57.52% when it was compared to control (0.459 nmol·mg-1protein), and sulfhydryl content in 20 mmol·L-1H2O2treatment group (19.853 nmol·mg-1protein) decreased by 74.04% when it was compared to control (76.471 nmol·mg-1protein). Both indicated that BSA protein oxidation became more severe with the extension of H2O2concentration. The result of secondary structure analysis indicated thatα-helix, random coil decreased significantly with the increase of ·OH (＜0.05), while β-sheet, β-turn increased significantly (＜0.05), which demonstrates BSA oxidation induced the α-helix structure become a linear structure. The exposure of hydrophobic residues led to the significant increase of protein surface hydrophobicity (＜0.05). The absolute value of Zeta potential was significantly decreased (＜0.05) with the increase of H2O2concentration, which demonstrated that the protein oxidation could significantly affect the surface charge of protein. Chemical interactions results showed that hydrogen bond and ionic bond were weakened significantly (＜0.05), with reduction of interaction between protein and water molecules and the protein hydration capacity.【Conclusion】BSA oxidation is H2O2concentration-dependent in hydroxyl radical oxidation system. Protein surface electrostatic charge decreased and protein secondary structure changed significantly as affected by protein oxidation,the interaction between protein and water molecules were reduced.

Bovine Serum Albumin (BSA); hydroxyl radical (·OH) oxidizing system; protein structure; hydration properties

2017-01-20；接受日期：2017-03-29

國家自然科學基金面上項目（31571787）

王策，Tel：010-62815950；E-mail：1551082195@qq.com。通信作者張春暉，Tel：010-62819469；E-mail：dr_zch@163.com