鼻炎靈片中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢測

張紅梅

(濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102)

鼻炎靈片中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢測

張紅梅

(濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102)

目的：通過萃取、過固相萃取小柱提取鼻炎靈片中的馬兜鈴酸Ⅰ，并用高效液相色譜法進行限量測定。方法：采用Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相：0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調pH至7.5）-乙腈（80∶20），檢測波長：250 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：35℃，進樣量：20 μL。結果：馬兜鈴酸Ⅰ在0.006 739～0.1348 μg/mL濃度范圍內，馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積與對照品濃度線性關系良好（r＝0.999 6，n＝5）；最低檢測限為0.16 ng/mL（信噪比為3∶1）；平均回收率為92.0%，RSD為1.8%（n＝6）。結論：經過本法測定，鼻炎靈片中未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

馬兜鈴酸Ⅰ；鼻炎靈片；高效液相色譜法；限量檢測

鼻炎靈片為炒蒼耳子、辛夷、白芷、細辛等8味中藥配伍組成，具有透竅消腫，祛風退熱的功效，在臨床上用于慢性鼻竇炎、鼻炎及鼻塞頭痛，濁涕臭氣，嗅覺失靈等。方中細辛含有微量的馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅰ為硝基菲羧酸類成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用，但同時又具有蓄積毒性，長期或過量服用易導致嚴重的腎毒性，表現為急、慢性馬兜鈴腎病、腎小管功能障礙等[1-3]。2004年8月，為保證人民群眾的用藥安全，國家食品藥品監督管理局根據對含馬兜鈴酸藥材及其制劑不良反應的報道以及毒副作用研究結果的分析，決定加強對含馬兜鈴酸藥材及其制劑的監督管理。為了更有效地控制鼻炎靈片的質量，保證臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法對鼻炎靈片中可能含有的馬兜鈴酸Ⅰ，進行限度檢查，為其在臨床中的合理應用提供參考和依據。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（1260VWD紫外檢測器，安捷倫公司；二極管陣列檢測器，島津公司）；Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；MS105DU電子分析天平（梅特勒公司），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

馬兜鈴酸Ⅰ對照品（批號：110746-201510，含量：99.1%，中國食品藥品檢定研究院），鼻炎靈片（河南潤弘本草制藥有限公司，批號：140801，140803，140805，140808，規格：0.3 g/片；山西華康藥業股份有限公司，批號：20150702，20150801，2010805，規格：0.3 g/片；天津同仁堂集團股份有限公司，批號：FP01002，FP01003，FP01006），碳酸銨為分析純（天津市大茂化學試劑廠），乙腈、甲醇均為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司），水為普利斯純凈水，其他試劑均為分析純。4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調pH至7.5）-乙腈（80∶20）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。結果見圖1。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液

取馬兜鈴酸Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含67.388 μg的溶液，作為儲備液，放入冰箱保存。

2.2 供試品溶液

取樣品60片，研細后，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇150 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液25 mL，至分液漏斗中，加濃氨溶液5 mL，用三氯甲烷提取3次，每次40 mL，棄去三氯甲烷層，堿液層用20%鹽酸溶液調節pH至2～3，再用三氯甲烷提取4次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，至蒸發皿中，水浴揮干，殘渣加甲醇5 mL分次使溶解、洗滌，加至依次用甲醇、水、甲醇各2 mL預洗的Bond Elut-SAX（Agilent，100 mg， 3 mL）固相萃取小柱上，依次用水、甲醇沖洗至洗滌液無色，棄去洗滌液，再用8%甲酸-甲醇溶液（8→100）4.5 mL洗脫，收集洗脫液至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性對照溶液

照處方制備不含細辛的陰性對照，再按供試品溶液項下的方法處理，即得。

3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×

圖1 鼻炎靈片中馬兜鈴酸Ⅰ含量的高效液相色譜圖

4 方法學考察

4.1 線性關系考察

精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品貯備液溶液（67.388 μg/mL）1.0 mL至l00 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，再用此溶液依次稀釋100，50，25，10，5倍，得系列濃度溶液，按上述液相色譜條件進樣20 μL，測得馬兜鈴酸Ⅰ的標準曲線：

A＝10 697C－19.778，

相關系數：r＝0.9996（n＝5），即馬兜鈴酸Ⅰ在0.006 739～0.134 8 μg/mL范圍內，峰面積（A）與對照品濃度（C）線性關系良好。

4.2 檢測限測定

按上述色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸對照品溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀釋進樣，結果表明：當馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的信噪比S/N約為3時，馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.16 ng/mL。

4.3 定量限測定

按上述色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸對照溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀釋進樣，結果表明：當馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的信噪比S/N約為10時，馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.53 ng/mL。

4.4 精密度試驗

照上述的液相色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液（0.0674 μg/mL）20 μL，注入液相色譜儀，連續測定6次，結果馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積RSD（n＝6）為0.9%，表明該方法儀器的精密度良好。

4.5 穩定性試驗

精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液（0.067 4 μg/mL），分別在0，1，2，4，8，12，24，48 h，照上述的液相色譜條件進樣，結果馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積RSD（n＝8）為4.5%，表明對照品溶液中馬兜鈴酸Ⅰ在48 h內保持穩定。

4.6 樣品測定

按照“2.2”項方法制備3個廠家的10批鼻炎靈片供試品溶液，按上述的液相色譜條件進行測定，結果均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

4.7 加樣回收率試驗

精密吸取河南潤弘本草制藥有限公司，批號為140803的樣品濾液6份各25 mL，分別精密加入對照品溶液（馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.482 8 μg/mL）1 mL，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按上述的液相色譜條件進行測定，用外標法計算回收率。結果供試品中馬兜鈴酸Ⅰ平均回收率為92.0%，RSD為1.8%，表明該測定方法測定結果準確。

5 討論與總結

5.1 結合文獻報道[4-5]及在二極管陣列檢測器下的測定，選擇了250 nm測定波長，在這個波長下，雜質峰相對比較少，而且檢出限相對比較高；并采用基線噪聲小，靈敏度高，峰形良好，與其他成分能達到基線分離的流動相0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調pH至7.5）-乙腈（80∶20）。

5.2 鼻炎靈片為中藥復方制劑，成分復雜，且馬兜鈴酸Ⅰ含量較低，共存組分干擾多，按照文獻[6-9]本文采用樣品經70%甲醇超聲提取，濾液經過酸堿處理、萃取濃縮后再經固相小柱進一步提純、富集。試驗中用兩種固相萃取小柱Bond Elut Plexa（Agilent，60 mg, 3 mL）和Bond Elut-SAX（Agilent ，100 mg，3 mL），結果經液相測定樣品溶液及回收率發現，前者的雜質峰較少，但回收率只有50%左右，后者相對雜質峰多，但不影響馬兜鈴酸Ⅰ的測定，且回收率能達到100%，而單獨用三氯甲烷酸堿提取后，雜質峰明顯比過固相小柱要多，且在馬兜鈴酸Ⅰ出峰位置基線不平。

5.3 由于是處方藥難以購得大量樣品進行檢測，只進行了10批樣品的檢測，經過本試驗，3個廠家的10批樣品均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ，可見只要按規定規范的制劑過程，鼻炎靈片不會含馬兜鈴酸Ⅰ，臨床使用是安全的。

[1] 陳婭娟,吳俏銀,葉惠蘭,等.馬兜鈴酸毒理研究進展[J].廣東藥學院學報,2003,19(2):156-157.

[2] 陳孟蘭,朱正蘭.馬兜鈴屬植物的生物活性和藥理作用研究進展[J].時珍國醫國藥,2007,18(3):702-704.

[3] 許海燕,王旭.馬兜鈴酸腎病防治研究進展[J].中國實用內科雜志,2015,35(1):74-76.

[4] 杜曉曦,周躍華,路金才,等.RP-HPLC法測定馬兜鈴酸含量方法的優化[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(7):47-49.

[5] 田夢,瞿俊勇,馬慧,等.馬兜鈴酸檢測技術的研究進展[J].湖南農業科學,2015,45(2):147-149.

[6] 唐秀玲,何頌華,謝譚芳.SPE-HPLC法測定消腫止痛酊中馬兜鈴酸A的含量[J].藥物分析雜志,2012,32(9):1690-1693.

[7] 周雪紅,李志浩,陳銀華,等.SPE-HPLC法測定麻黃止嗽丸中馬兜鈴酸A的含量[J].中醫藥導報,2015,22(14):44-46.

[8] 陳娜娜,李彥超,宋漢敏,等.SPE-HPLC法測定辛芩膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量[J].中醫研究,2014,27(1):72-74.

[9] 薛利華.乳沒鎮痛膠囊中馬兜鈴酸的含量測定研究[J].陜西中醫,2015,36(4):492-493.

本文編輯：魯守琴

Limited Determination of Aristolochic Acid Ⅰ in Biyanling Tablet

Zhang Hong-mei
(Jinan Center for Food and Drug Control, Jinan city, Shandong Jinan 250102,China)

Objective：To establish a HPLC method for detecting the content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet. Methods：The content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet was determined by HPLC on a Shim-pack VP-ODS column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with the column temperature at 35℃. The mobile phase was 0.3% ammonium carbonate solution (pH was adjusted to7.5 with 20% hydrochloric acid) - acetonitrile (80∶20, V/V). The detection wavelength was set up at 250 nm. The fow rate was set at 1.0 mL/min, and the injection volume was 20 μL. Results：The determination of aristolochic acid Ⅰ kept the good linearity relation in the content range of 0.006 739 μg/mL～0.134 8 μg/mL (r＝0.999 6, n＝5), the limit of detection was 0.16 ng/mL (SNR of 3∶1), the mean recovery rate was 92.0%, and the RSD was 1.8% (n＝6). Conclusion：Aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet cann’t be determined out.

Aristolochic Acid Ⅰ; Biyanling Tablet; HPLC; Content Limit Determination

R286

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.020

2017 - 04 - 07

張紅梅，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品檢驗及質量標準研究。E-mail：zhhm3a@sina.com.cn