植物生長調節劑對紫霞黃櫨組織培養的影響

吳凡+趙蓓蓓+王浩

摘要：以紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）為材料，組培紫霞黃櫨外植體，獲得最適宜紫霞黃櫨的組培條件，得到一套紫霞黃櫨苗木資源大規模生產的組織培養技術規范。最適宜的誘導分化培養基為MS基礎培養基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，扦插苗、一年生枝條和二年生枝條作為外植體的誘導率分別達到96.7%、93.3%和73.3%。外植體材料在5～8月適宜采集。增殖培養最適宜條件為以改良MS培養基作為基礎培養基，pH調至5.4，添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA并添加1 mg/L維生素C，評價得分4.23分，增殖系數最高達到8.97。生根培養使用MS改良培養基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA時生根率達到53%。移栽以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質，溫度控制為25 ℃，相對濕度保持在90%，移栽后組培苗成活率達到70%。使用該方法可大幅提高紫霞黃櫨增殖數量。

關鍵詞：紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）；組織培養；改良MS培養基

中圖分類號：Q943.1；S687 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2942-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.036

Abstract： Continus coggygria var. ‘Zixia was used as the material to cultivate the explants of ‘Zixia through tissue culture. Aim to obtain the optimum culture condition of ‘Zixia and study the key technology of tissue culture and rapid propagation for ‘Zixia，in order to get a set of large-scale production of ‘Zixia seedling tissue culture technical specifications. The optimum inducing differentiation medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，the sprouting rate of cutting seedling，annual branches and biennial branches were 96.7%， 93.3% and 73.3% respectively. The suitable time for obtained explants were May to August. The optimum conditions for the proliferation culture were as follows：us modified MS medium，the pH was adjusted to 5.4， add 100 μmol/L 6-BA，1 μmol/L NAA， 10 μmol/L IAA， and 1 mg/L VC. The score was 4.23 and the proliferation coefficient reached 8.97. In the rooting culture stage was use modified MS medium，add with 0.3 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA， the rooting rate was 53%. During the transplanting stage， the perlite with sterile was used as the substrate，the temperature of greenhouse was controlled at 25 ℃，the relative humidity was kept at 90%，and the survival rate of plantlet was 70%. The use of this method can greatly improve proliferation of Cotinus coggygria var. ‘Zixia.

Key words： Continus coggygria var. ‘Zixia； tissue culture； modified MS medium

紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）是漆樹科（Anacardiaceae）黃櫨屬（Cotinus spp.）落葉小喬木或灌木。紫霞黃櫨品種是黃櫨的實生苗中發現的變異株，其當年生嫩芽、葉片和枝條在整個生長季呈紫紅色，并保留了黃櫨樹種耐寒、耐旱、耐瘠薄和耐堿性土壤的生長特性[1]，當年苗高可達1 m左右，可運用于園林工程進行塊狀和帶狀種植，其長大成苗后可在庭院中孤植，也可在綠地中群植。紫霞黃櫨觀賞性佳，環境適應性強，應用范圍廣泛，其景觀效果壯觀，是良好的具有北京市綠化植物潛力的彩葉樹種資源[2]。然而，紫霞黃櫨作為黃櫨的變異株，苗木數量少，扦插繁殖成活率低，從而大大限制了其生產效率。

組織培養是良種苗木快速繁育的有效途徑[3]。張永紅[4]、李彧[5]、苗青等[6]都對黃櫨屬或漆樹科植物進行過組培研究報道。但是通過實踐探究發現，黃櫨和美國紅櫨的組織培養技術并不完全適用于紫霞黃櫨的擴繁增殖，主要存在問題有外植體消毒困難、污染率高、增殖階段增殖系數低、褐化現象嚴重、繼代培養困難、生根階段生根率低[7-11]。國內鮮見對紫霞黃櫨進行組織培養方式快繁的研究，本研究通過探究消毒方法、培養基配方和生長調節劑對紫霞黃櫨外植體組織培養的影響，旨在篩選出一整套最適宜紫霞黃櫨外植體組織培養的條件，提高其快繁效率，為北京市提供大量優質的彩葉綠化資源。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

紫霞黃櫨苗木材料由北京市黃垡苗圃提供，分別剪取生長健康、長勢良好的成年植株上的一年生嫩枝、芽和二年生硬枝作為材料。獲得紫霞黃櫨無菌外植體的方法：實生苗一年生枝條和二年生枝條均使用75%乙醇滅菌30 s后用無菌水沖凈，HgCl2處理8 min。組培室培養條件均為溫度25 ℃，光照時間16 h/d，光照度2 000 lx。

1.2 藥品和設備

6-BA、NAA、IAA、2，4-D等藥品采購于Sigma aldrich公司；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備公司；YS-CZ-DD單人超凈工作臺、YS-LED-18照明燈管：易生石木（北京）生物科技有限公司。SYQ-DSX-280A高溫高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。PLT-250培養瓶：濟南普朗特生物科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 誘導分化培養基設計 誘導分化培養基采用MS基礎培養基，分別選取1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA，0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L NAA，采用雙因素隨機區組試驗設計法（表1），添加30 mg/L蔗糖，6 g/L瓊脂并將pH調至5.7，將滅菌后的外植體材料接入誘導分化培養基，每個處理接10個外植體，平行重復3次。

1.3.2 繼代增殖培養基礎培養基選擇 將誘導分化后的外植體分別接入DKW、WPM、MS、1/2 MS、MS改良基礎培養基，并添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，pH調至5.7，每個處理接10個外植體，平行重復3次。

1.3.3 培養基pH對外植體增殖的影響 選用改良MS培養基作為基礎培養基，添加1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH分別調至4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0。

1.3.4 繼代培養基添加不同植物生長調節劑正交試驗 根據正交試驗設計表[12]設計四因素四水平正交試驗，分別選取0、1、10、100 μmol/L 4種濃度水平的6-BA、NAA、IAA、2，4-D 4種植物生長調節劑。將紫霞黃櫨無菌外植體莖段接入MS改良培養基，并按照表1添加不同濃度生長調節劑，30 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，調節pH至5.6～5.8。每瓶接種1個莖段，每個處理共接10個外植體，平行重復3次。

1.3.5 生根培養基設計 將長勢良好的紫霞黃櫨外植體轉入MS改良培養基中，添加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH調至5.4，然后分別添加0.1、0.2 mg/L NAA，0.1、0.2、0 mg/L IBA進行雙因素隨機區組生根培養試驗，每個處理接10個外植體，平行重復3次。培養30 d對比生根情況。

1.3.6 生根苗移栽 取出生根的紫霞黃櫨組培苗，洗凈培養基，栽入營養缽中，基質為珍珠巖，生根苗溫室溫度控制在25 ℃，空氣相對濕度90%，移栽后30 d統計成活率。

1.4 統計與分析

外植體分化培養，組培苗增殖培養和生根培養每3 d定時進行觀察統計，測定其出芽率、增殖系數和生根率。分別于培養后15 d和30 d時統計生長狀況。

污染率=（污染株數/接種總數）×100%

成活率=（成活個數/接種總數）×100%（受污染的外植體視為死亡）

出芽率=（出芽株數/接種總數）×100%

增殖系數=（試驗后叢生芽數量/試驗前叢生芽數量）×100%

1.5 數據分析方法

試驗數據分析采用IMB SPSS Statistics 19軟件進行單因素方差分析[13]；正交試驗數據采用Minitab 17軟件進行正交試驗數據分析[14]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NAA、6-BA對外植體叢生芽誘導的影響

使用紫霞黃櫨一年生嫩枝作為外植體時，誘導培養結果如圖1所示。對照組誘導率為13.33%，說明一年生嫩枝材料適宜誘導培養。但添加植物生長調節劑后大部分處理誘導效果均沒有扦插苗作為外植體時誘導率高。僅1號處理添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時誘導率高，達到93.33%。2號、3號、6號、7號、11號和12號處理誘導率較高，分別達到63.3%、60.0%、56.7%、70.0%、63.3%和66.7%。

使用紫霞黃櫨二年生硬枝作為誘導材料時，結果如圖2所示。對照組誘導率為0，不能誘導出芽。所有處理的效果均不如使用扦插苗或一年生嫩枝作為材料，1號處理誘導率最高，達到73.33%。

2.2 繼代增殖培養基礎培養基選擇

不同增殖培養基接種紫霞黃櫨外植體培養試驗結果如圖3所示，在使用不同培養基對紫霞黃櫨外植體進行誘導時，增殖效果由好至壞依次為MS改良培養基、1/2 MS培養基、MS培養基、WPM培養基和DKW培養基，增殖系數分別為6.27、3.94、2.38、0和0。

2.3 培養基pH對組培苗增殖的影響

不同pH培養基接種紫霞黃櫨外植體進行培養，試驗結果如圖4所示，pH由4.8～6.0逐漸升高的過程中，外植體培養的評價得分呈先升高再降低的趨勢。其中，在pH為5.4時增殖系數達到4.7。

2.4 繼代培養基添加不同植物生長調節劑的正交試驗

由圖5可知，1號處理4種植物生長調節劑濃度均為0，作為對照組，增殖系數為0。培養15 d后增殖效果最好的是14號處理，增殖系數8.97，組間偏差小，并且組培苗莖伸長明顯，長勢良好；8號和10號處理結果次之，增殖系數分別為5.47和5.50，同樣莖部伸長明顯；2號、6號、7號和13號處理增殖系數分別為3.33、4.50、4.72和3.89，其中的外植體產生大量愈傷組織，并在愈傷組織上產生不定芽，但是芽并不能向上伸長；11號、12號、15號和16號的增殖系數分別為2.33、3.85、2.67和4.16，組間差異較大，外植體生長狀態不穩定；3號、4號、5號、9號試驗處理效果差，組培苗死亡較多，愈傷組織不明顯，不能增殖。endprint

利用Minitab進行方差分析多重比較，結果見表3。從表3可以看出，在α=0.05水平下，4種植物生長調節劑對紫霞黃櫨外植體增殖影響的大小順序為NAA>6-BA>2，4-D>IAA，相比較IAA，其余3種植物生長調節劑對紫霞黃櫨外植體的增殖具有顯著影響。

從圖6的極差分析多重比較中發現，6-BA濃度在100 μmol/L、NAA濃度為1 μmol/L、IAA在濃度為10 μmol/L時處理效果最好。2，4-D的4種濃度處理中，0 μmol/L即不添加2，4-D時效果最好，隨著2，4-D濃度增大，極差逐漸下降并且趨勢明顯，雖然2，4-D對外植體增殖有顯著影響，但是其對于紫霞黃櫨組培苗生長起負面作用。

2.5 生根培養結果

如圖7所示，使用MS改良培養基作為基礎培養基，不添加IBA、NAA時，生根率為0。在NAA分別為0.1、0.2 mg/L時，隨著IBA從0.1、0.2、0.3 mg/L逐漸升高，生根率也逐漸升高；在添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA時生根率最高，達到53%。

2.6 生根苗的馴化移栽

將已生根的紫霞黃櫨組培苗從培養瓶中取出，洗凈殘留瓊脂，移栽至玻璃溫室的營養缽中，以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質，溫室內25 ℃，相對濕度保持在90%。30 d后觀察其成活情況，成活率達到70%。健壯的組培苗易于成活并且能長出新葉。

3 討論與結論

3.1 討論

誘導分化階段無論是一年生嫩枝、芽還是二年生硬枝都使用MS基礎培養基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，并取得了較好的誘導效果。相比較而言，扦插苗的整體誘導率高于一年生嫩枝和二年生硬枝，隨著6-BA和NAA濃度的逐漸升高，反而對其誘導產生了抑制作用。可以推測低濃度的NAA在新生芽誘導中起調控作用，高濃度的NAA對新生芽誘導的抑制性較強。

在增殖培養基的選擇試驗中發現WPM和DKW不適用于紫霞黃櫨的組織培養，這可能是由于其中微量元素比例不合適。在以往的黃櫨和美國紅櫨組培試驗中都使用MS培養基作為基礎培養基[15-17]，MS培養基適宜于大部分外植體的組培，但是對于紫霞黃櫨的增殖效果卻不理想，培養約15 d后外植體開始出現葉片發黃、萎蔫和脫落等現象，這有可能是氮元素過多導致的。通過改良后，得到改良MS培養基，增殖培養階段較適宜紫霞黃櫨增殖生長，所以當使用1/2MS或是MS改良培養基將大量元素減半后，組培苗的長勢明顯比使用MS培養基有所提高，并且不易出現葉片、莖段發黃死亡的現象。紫霞黃櫨作為彩葉樹種，其葉片中葉綠素與花青素、胡蘿卜素的比例較小，葉片中葉綠素含量和其他具體成分與生長機理尚未探明，有待進一步研究。

從試驗結果可以看出，紫霞黃櫨外植體在4.5～6.0的pH條件下都可以存活，但是在pH為4.5、4.8和6.0時存活情況較差，并且不能增殖；在pH為5.1～5.7可較好生長，pH 5.4左右應為最佳pH，增殖系數4.7。

在4種植物生長調節劑處理的增殖培養正交試驗中，參照Peter等[18]的方法，選取6-BA、NAA、 IAA、2，4-D，分別采用0、1、10、100 μmol/L 4種濃度進行四因素四水平正交試驗，培養15 d后增殖效果最好的是14號處理，評價得分4.23分，增殖系數8.97，組間偏差小，并且組培苗莖伸長明顯，長勢良好，底部有愈傷組織形成，發生不定芽，將愈傷組織切開后可繼續培養并發生不定芽；8號和10號處理生長表現良好，并且莖部伸長明顯，這可能是由于這兩組處理中含有適量的6-BA并且有較多含量的IAA造成的。

6-BA在0～100 μmol/L范圍內濃度越高，對組培苗生長影響越好，當使用大于100 μmol/L濃度時效果有待探討；NAA與其他3種植物生長調節劑相互作用時，在1 μmol/L濃度時對組培苗生長效果明顯，隨著NAA濃度提高，組培苗長勢減弱，并且基部容易產生較大的愈傷組織；IAA在10 μmol/L時最為適宜；2，4-D不添加時效果最好，隨著2，4-D濃度增加組培苗生長效果變差。通過數據分析得到的最優組合為100 μmol/L 6-BA+1 μmol/L NAA+10 μmol/L IAA。

生根難度大一直以來是制約木本植物組培快繁的問題之一。生根培養階段，在MS改良培養基的基礎上添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA時生根率最高，但生根率僅有53%，尚不能滿足大量培育生產的要求。因為受材料數量限制，生根試驗僅用了0.1～0.3 mg/L IBA和0.1、0.2 mg/L NAA，在試驗范圍內生根率隨著激素濃度升高而升高，后續試驗可以繼續提高2種植物生長調節劑的濃度觀察組培苗生根率。

移栽階段時，實際試驗中發現紫霞黃櫨組培苗個體間差異大，重復性不強。從同一植株取得材料表現相近，其中在誘導培養階段長勢良好的外植體在增殖培養階段也會有相應地表現，并且在生根后移栽時易于成活。

3.2 結論

以紫霞黃櫨為材料，通過采用組織培養技術培育外植體，最適宜的誘導分化培養基為MS基礎培養基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，一年生枝條和二年生枝條作為外植體的誘導率分別達到93.3%和73.3%。增殖培養最適宜條件為使用改良MS培養基作為基礎培養基，pH調至5.4，同時添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA，增殖系數最高達到8.97。生根培養階段使用MS改良培養基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA時生根率達到53%。移栽階段以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質，溫度控制為25 ℃，相對濕度保持在90%，移栽后組培苗成活率達到70%。使用該方法可整體大幅提高紫霞黃櫨增殖的數量，為今后大規模培育該品種苗木資源提供理論依據。endprint

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