石榴花中多酚、黃酮及萜類物質同步提取工藝優化

李欣宇+賈秀穩+楊林

摘要：為更有效地利用石榴（Punica granaum L.）花中多種活性成分，以石榴花為原料，利用乙醇溶劑浸提法，在單因素試驗的基礎上選擇提取溫度、提取時間、液固比、乙醇體積分數4個因素進行正交試驗，優化了石榴花中3種活性物質同步提取工藝。結果表明，影響石榴花中多酚、黃酮及萜類物質同步提取的因素大小順序為提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>液固比，其最優的工藝條件為60%乙醇溶液作為提取溶劑，液固比20∶1（mL∶g），85 ℃條件下提取2.0 h；在此條件下多酚、黃酮及三萜類物質的提取率分別是22.19%、6.53%、0.94%。石榴花中多酚、黃酮及萜類物質可以同步提取出來，可有效提高石榴花資源的利用率。

關鍵詞：石榴（Punica granaum L.）花；多酚；黃酮；萜類；同步提取

中圖分類號：R962 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2926-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.032

Abstract： The aim is to provide a theoretical foundation for realizing the more efficient use of various ingredients from pomegranate flowers. Using the method of ethanol solvent extraction and pomegranate flowers as raw materials，the orthogonal experiment was carried out by choosing extraction temperature，extraction time，the ratio of liquid to solid and the volume fraction of ethanol on the basis of single factor experiment. The results showed that the sequence of influencing factors of polyphenols，flavonoids and terpenes extraction from pomegranate flowers were extraction temperature>extraction time>ethanol volume percentage>the ratio of liquid to solid. The best extraction conditions were 60% ethanol，the ratio of liquid to solid of 20∶1（mL∶g），the extraction temperature of 85 ℃，the extraction time of 2.0 h. Under the optimal conditions，the content of polyphenols，flavonoids and triterpenoids substances in extracts were respectively 22.19%，6.53% and 0.94%. It indicated that polyphenols，flavonoids and terpenes can be extracted synchronously from pomegranate flowers. It improved the availability of pomegranate flowers resources effectively.

Key words： pomegranate（Punica granaum L.） flowers；polyphenols；flavonoids；terpenes；synchronous extraction

石榴（Punica granaum L.）屬于石榴科石榴屬植物，落葉灌木或小喬木[1]。石榴花期長，開花量大，資源豐富[2]。石榴花中含有豐富的活性成分，其中以多酚類、類黃酮和三萜類物質為主[3，4]。這些活性成分具有抗氧化[5，6]、預防或抑制腫瘤[7，8]、抗菌[9]、抗動脈粥樣硬化[10，11]、降血脂[12]、預防或治療冠心病和中風等心腦血管疾病的生理功效[13-15]。因此，借助各種技術手段從石榴花中提取生物活性物質已成為目前的研究熱點。

對于石榴花中的多酚、黃酮及萜類物質，目前多數僅提取和純化其中一種成分，造成資源的浪費。如史曉華[16]用響應面超聲酶法探究了石榴花中的總黃酮提取工藝，熱依木古麗·阿布都拉等[17]用有機溶劑浸提法對新疆石榴花多酚的提取工藝進行研究，Fu等[18]采用超聲波輔助提取法對石榴花中齊墩果酸和熊果酸等三萜類物質的最佳工藝進行了探索。目前，對石榴花中多酚、黃酮及萜類物質的同步提取研究鮮見報道。本研究在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化同步提取石榴花中多酚、黃酮及萜類物質工藝條件，旨在為充分利用石榴花中的生物活性成分，為石榴花資源的綜合利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴花樣品，品種為崗榴，于2015年6月采自棗莊學院校園，由棗莊學院生命科學學院植物學教研室張立華教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴的花，樣品于65 ℃恒溫烘干，放置于冰箱貯存備用。

沒食子酸、熊果酸、蘆丁標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；高氯酸、乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、香草醛、亞硝酸鈉、無水碳酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純，試驗用水為去離子水。endprint

1.2 儀器與設備

UV-2600型紫外可見分光光度計[尤尼科（上海）儀器有限公司]；電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；HH·SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；LK-2000A型搖擺式高速中藥粉碎機（新昌縣城關紅利數控制造廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

1）提取溫度對提取率的影響。精確稱取5份0.50 g石榴花粉末分別置于150 mL錐形瓶中，在液固比30∶1（mL∶g，下同）、提取時間2.0 h、乙醇體積分數為70%的條件下，考察不同提取溫度（55、65、75、85、95 ℃）對多酚、黃酮和萜類提取率的影響。

2）提取時間對提取率的影響。精確稱取5份0.50 g石榴花粉末分別置于150 mL錐形瓶中，在液固比30∶1、提取溫度75 ℃、乙醇體積分數為70%的條件下，考察不同提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對多酚、黃酮和萜類提取率的影響。

3）液固比對提取率的影響。精確稱5份0.50 g石榴花粉末分別置于150 mL錐形瓶中，按照液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入體積分數為70%的乙醇，溫度75 ℃條件下提取時間2.0 h，考察不同液固比對多酚、黃酮和萜類提取率的影響。

4）乙醇體積分數對提取率的影響。精密稱取5份0.50 g石榴花粉末分別置于150 mL錐形瓶中，在提取時間2.0 h、提取溫度75 ℃、液固比為30∶1的條件下，考察不同乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%，90%）對多酚、黃酮和萜類提取率的影響。

1.3.2 正交試驗設計 根據單因素試驗結果，以提取溫度、提取時間、液固比及乙醇體積分數4個因素為考察因素，以綜合指標作為評價依據，進一步優化工藝參數。

1.3.3 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法，參照文獻[19]的方法并略作改進，具體操作步驟：取適量經稀釋后的提取液于試管中，再加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，再加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置5 min，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，再加入0.7 mL 65%的乙醇溶液補充至6 mL，搖勻后放置5 min，于510 nm處測定其吸光度。以蘆丁為標準品，并按公式計算相應的提取率。

式中，M為多酚、黃酮或萜類物質的質量（g），m為原料的質量（g）。

1.3.4 多酚含量的測定 多酚含量的測定采用福林-酚比色法，參照國家藥典[20]中的方法并略作改進，具體操作步驟：加入1 mL Folin試劑于試管中，再加入適量經稀釋后的提取液，用去離子水補齊至4 mL，之后加入6 mL 10%的NaCO3溶液，反應體系的總體積為10 mL，反應30 min后在750 nm處測定其吸光度。以沒食子酸為標準品，按照公式計算總多酚的提取率。

1.3.5 萜類物質含量的測定 萜類物質的含量測定參照文獻[21]中的方法并略作改進，具體操作步驟：取適量提取液于試管中，經揮干溶劑后加入5%香草醛乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，將容量瓶放入60 ℃水浴中加熱15 min，放冷至室溫，再加冰醋酸4 mL，搖勻。置于548 nm處測定其吸光度。以熊果酸為標準品，并按照公式計算萜類物質的提取率。

1.3.6 統計分析 試驗均設3個重復，試驗數據以平均值±標準差（mean±SD）表示。采用Microsoft Office Excel和Origin Pro 8.0數據分析工具進行處理。

2 結果與分析

2.1 同步提取單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可以看出，隨著提取溫度的逐漸增大，3種活性物質的提取率均呈先增加后下降的趨勢。在提取溫度為75 ℃時，黃酮和多酚的提取率最高，85 ℃時，萜類的提取率最高，再升高溫度，這3種物質的提取率反而有所下降。原因可能是在適宜的溫度范圍內，這3種活性物質的熱運動加劇，溶劑分子更易于進出細胞，同時多酚、黃酮和三萜類物質的溶出量也增加。但過高的溫度會增加提取物的黏性，阻礙3種活性物質的溶出，從而使其提取率下降。

2.1.2 提取時間的影響 由圖2可知，隨著提取時間的逐漸增加，3種活性物質的提取率均呈先增加又下降或趨于平緩的趨勢。當提取時間為2.0 h時，三萜類物質的提取率最高，隨后呈略下降的趨勢；提取2.5 h時，多酚和黃酮類物質的提取率達到最大，但進一步延長時間，提取率有所下降，可能是由于加熱過程中黃酮、多酚等具有活潑酚羥基的物質發生氧化、聚合等反應，使提取率下降[22]，三萜類化合物的結構在長時間受熱的情況下也可能發生變化，導致其提取率下降[23]。因此，綜合考慮生產效益，正交試驗中提取時間設置為1.5～2.5 h對3種物質的提取均較適宜。

2.1.3 液固比的影響 由圖3可知，黃酮和三萜類化合物在液固比為20∶1時提取率達到最高，在液固比超過20∶1之后，三萜類物質則表現出明顯的下降趨勢，黃酮類物質則趨于穩定，在液固比為40∶1時提取率才明顯下降，多酚提取率在30∶1之前明顯上升，液固比為40∶1之后明顯下降。綜合上述，由3種活性物質提取率的變化趨勢分析得到，提取劑使用量越大，溶液的滲透壓也會越大，對3種化合物的滲出均有利，而且較大的溶劑量能夠增加它們與溶劑的接觸面積。但當液固比達到一定數值后，溶液體系中的滲透壓已經趨于平衡，石榴花中大部分的活性物質已經滲出。因此，考慮到繼續增加溶劑用量并不能提高3種物質的提取率，而且液固比越大，會增加其他物質的溶出還會導致提取率下降，同時也會增加后期濃縮時的能量消耗[24]。因此，正交試驗中液固比設置為20∶1～40∶1。endprint

2.1.4 乙醇體積分數的影響 由圖4可知，在一定范圍內，隨著乙醇體積分數的逐漸增大，3種活性物質的提取率均不同程度增加。乙醇體積分數為60%時，黃酮和多酚的提取率最高；乙醇體積分數為70%時，三萜類物質的提取率達到最高。根據相似相溶原理[25]，3種活性物質的溶出度與溶劑和這3種物質的極性有關。多酚和黃酮的極性相對較強，體積分數為60%的乙醇有利于二者提取；三萜物質極性較差，70%的乙醇有利其提取。因此，正交試驗中乙醇的體積分數設置為50%～70%。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、液固比（C）和乙醇體積分數（D）4個條件作為影響3種活性物質提取的考查因素，采用 L9（34）正交試驗進一步優化提取工藝，每組試驗3個平行樣，取平均值進行計算，并對結果進行極差分析，影響因素和水平見表1，正交試驗結果見表2，因素水平直觀分析見圖5。

從表2、圖5可以看出，4個因素對3種活性物質提取的影響顯著。極差分析表明，對于多酚和黃酮，影響最大的因素是提取溫度，影響最小的是乙醇體積分數，但對于萜類物質來說，影響最大的因素是液固比，影響最小的是提取溫度。考慮到萜類物質所占比例較小，兼顧3種物質的總提取效率，綜合評定影響3種物質同步提取的因素排列順序為提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>液固比。黃酮的最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即最佳提取工藝條件為60%乙醇作為提取溶劑，在液固比20∶1、85 ℃條件下提取2.0 h。多酚和萜類物質的最佳提取工藝條件表現一致，均為A3B2C3D3，即最佳提取工藝條件為以70%乙醇為提取溶劑，在液固比40∶1、85 ℃條件下提取2.0 h。

2.3 驗證試驗結果

為確定最優的工藝條件，對A3B2C3D3和A3B2C1D2兩種組合進行了驗證性試驗，具體工藝條件及結果見表3。結果表明，在A3B2C3D3組合工藝條件下，多酚、黃酮和萜類物質的提取率分別為21.62%、6.73%、1.13%，在A3B2C1D2組合條件下，多酚、黃酮及萜類物質的提取率分別為22.19%、6.53%、0.94%。在組合①試驗條件下，黃酮和三萜類的含量稍高，在組合②試驗條件下多酚的含量稍高，但3種活性物質的總提取率而言，組合②工藝組合稍高于組合①。而且組合①的液固比40∶1遠高于組合②的20∶1，過多的溶劑不利于后續濃縮[26]，還會造成溶劑的浪費及增加石榴花中其他雜質成分的溶出。因此，從節約及后續處理等方面綜合考慮，選擇液固比為20∶1的②為最優提取工藝，即在85 ℃下，按照20∶1的比例，用60%的乙醇浸提2.0 h。驗證試驗表明，該組合條件下，多酚、黃酮及三萜類物質的提取率高于正交試驗中的其他組合，說明此方案穩定可行。

3 結論

在單因素試驗的基礎上選取提取溫度、時間、液固比和乙醇體積分數4個因素進行正交試驗考察，結果表明，影響石榴花中多酚、黃酮及三萜類物質同步提取的順序為提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>液固比。經過驗證試驗確定最佳工藝組合為A3B2C1D2，即提取溫度85 ℃，提取時間為2.0 h，液固比為20∶1，乙醇體積分數為60%。在此工藝條件下，多酚、黃酮及萜類物質的提取率分別是22.19%、6.53%和0.94%。表明石榴花中這3種活性物質可以被同步提取出來，對于綜合利用石榴花中的活性物質具有指導意義。

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