高壓微射流處理對(duì)葡萄籽原花青素組分構(gòu)成的影響

劉夢(mèng)培，鐵珊珊，縱 偉*，張麗華，趙光遠(yuǎn)

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

高壓微射流處理對(duì)葡萄籽原花青素組分構(gòu)成的影響

劉夢(mèng)培，鐵珊珊，縱 偉*，張麗華，趙光遠(yuǎn)

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

研究高壓微射流處理對(duì)從葡萄籽中提取得到的原花青素中兒茶素、原花青素B2和表兒茶素含量的影響。將原花青素在不同的處理壓力（100、140、180、220 MPa和260 MPa）條件下進(jìn)行1～4 次循環(huán)處理，采用高效液相色譜進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：隨著處理壓力的增加，兒茶素、原花青素B2和表兒茶素含量隨之增加；隨著處理次數(shù)的增加，含量基本呈先增加后減少的趨勢(shì)；與其他處理?xiàng)l件下的原花青素含量相比，260 MPa條件下循環(huán)處理兩次，兒茶素（0.163 2 mg/mL）、表兒茶素的質(zhì)量濃度（0.128 6 mg/mL）最高；260 MPa條件下循環(huán)3 次獲得的原花青素B2質(zhì)量濃度（0.057 6 mg/mL）最高。說(shuō)明高壓微射流處理會(huì)破壞高聚原花青素分子鏈之間的非共價(jià)鍵，使其解聚生成活性更高的單體、低聚體。

動(dòng)態(tài)高壓微射流；兒茶素；原花青素B2；表兒茶素；高效液相色譜

原花青素又稱縮合單寧，通常存在于植物的果實(shí)和種子中，在谷物、蔬菜和水果中含量較為豐富[1-3]。它是由兒茶素和表兒茶素單體以及這些單體通過(guò)C2-O-C7的醚鍵和C4-C8/C4-C6兩個(gè)鍵連接在一起（A型）或者C4-C8/ C4-C6一個(gè)鍵結(jié)合（B型）而成的低聚體和高聚體組成的混合物[4-6]。聚合度2～4的為低聚原花青素，聚合度大于4的為高聚原花青素[7]。原花青素的抗氧化活性與聚合度有很大的關(guān)系，單體的抗氧化活性低于二聚體，其抗氧化活性隨著聚合度的升高而降低[8-9]。趙平等[10]研究發(fā)現(xiàn)采用酸處理可以使平均聚合度為6.28的高聚原花青素水解為平均聚合度為2.74的低聚原花青素（乙醇體積分?jǐn)?shù)為39%）；Qi Yajing等[11]研究發(fā)現(xiàn)在酸性條件下兒茶素可以促進(jìn)高粱高聚原花青素解聚生成低聚原花青素。

動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）均質(zhì)技術(shù)是一種特殊的均質(zhì)技術(shù)[12-13]，主要利用高速壓力、高頻振動(dòng)、瞬時(shí)壓力下降、強(qiáng)烈的剪切、空穴爆炸力和短時(shí)間內(nèi)（少于5 s）達(dá)到一定壓力等綜合作用達(dá)到相應(yīng)的目的[14-15]，其在處理過(guò)程中只發(fā)生物理變化。Lagoueyte等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃原膠經(jīng)高壓微射流處理后其非共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致高聚體降解為小的聚合體；章文琴等[17]研究發(fā)現(xiàn)可溶性膳食纖維經(jīng)DHPM處理后，分子氫鍵斷裂重組、側(cè)鏈斷裂、分子質(zhì)量降低；新疆大學(xué)敬思群等[18]研究發(fā)現(xiàn)采用DHPM輔助提取技術(shù)提取原花青素，會(huì)對(duì)原花青素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。但關(guān)于DHPM物理改性對(duì)原花青素具體的影響機(jī)制報(bào)道較少。

兒茶素是一種黃酮類物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、抗癌等作用[19]；原花青素B2為二聚體，具有抗氧化、抗腫瘤等活性[20]；表兒茶素是一種在人類飲食中含量豐富的黃酮類物質(zhì)，具有降血壓、血脂的作用[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究DHPM處理結(jié)合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法研究DHPM處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素中兒茶素、原花青素B2和表兒茶素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽提取物（原花青素含量≥95%）、兒茶素、原花青素B2以及表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；乙腈、甲醇、乙醇、冰乙酸均為色譜級(jí) 國(guó)藥集團(tuán)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FPG12800高壓納米均質(zhì)機(jī) 安盛聯(lián)合科技有限公司；XP205微量天平 瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；1525-2489型HPLC儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

HPLC系統(tǒng)由1525高壓泵和2489紫外-可見檢測(cè)器組成。色譜柱為SunFireTMC18（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，樣品的上樣體積為20 μL。流動(dòng)相A為0.4%的醋酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫程序?yàn)椋?～55 min，5%～20% B；55～70 min，20%～25% B；最后用5%流動(dòng)相B與95%流動(dòng)相A平衡5 min，以備下次進(jìn)樣。總流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm[22]。

1.3.2 原花青素的處理

將5 g原花青素溶于50%的乙醇溶液中，定容至1 000 mL，超聲溶解20 min。然后采用DHPM在不同的處理壓力（100、140、180、220 MPa和260 MPa）條件下進(jìn)行1～4 次循環(huán)處理，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，與原液進(jìn)行比較，分析DHPM對(duì)原花青素中兒茶素、原花青素B2以及表兒茶素的影響。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取兒茶素、原花青素B2和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品各4 mg分別溶于50%的乙醇溶液中，定容至10 mL的棕色容量瓶中，以此為母液稀釋至不同的質(zhì)量濃度（0.40、0.25、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/mL），經(jīng)0.45 μm的微孔過(guò)濾后用于HPLC分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5、SPSS等軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述的HPLC條件測(cè)定兒茶素（0.15 mg/mL）、原花青素B2（0.04 mg/mL）、表兒茶素（0.15 mg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。由圖1可知，3 種混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC完全分離且基線平穩(wěn)，說(shuō)明該方法可以用來(lái)測(cè)定不同處理?xiàng)l件下原花青素中兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的含量[23]。

圖 1 3 種混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of mixture of three standards

為了準(zhǔn)確測(cè)定兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的含量，分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度梯度下的這3 種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算3 種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表1中可知，回歸系數(shù)R2均大于0.990 0，說(shuō)明各種標(biāo)準(zhǔn)品的溶液質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[24]，可以準(zhǔn)確反映出原花青素中各物質(zhì)的含量。

表 1 3 種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、回歸方程Table 1 Retention times and regression equations of three standards

2.2 原花青素HPLC譜圖

圖 2 不同處理壓力和循環(huán)次數(shù)下原花青素的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatograms of proanthocyanidins subjected to different cycles of DHMP at different pressures

由圖2可知，不同條件下原花青素的變化趨勢(shì)一致，但相對(duì)峰面積有所不同，隨著處理壓力增大，兒茶素、原花青素B2以及表兒茶素的相對(duì)峰面積呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，說(shuō)明高壓微射流處理對(duì)原花青素的組分含量具有影響。

2.3 DHPM處理對(duì)原花青素組分的影響

圖 3 DHPM處理壓力和循環(huán)次數(shù)對(duì)原花青素中兒茶素含量的影響Fig. 3 Effect of DHMP cycle and pressure on catechin content of GSPE

2.3.1 DHPM處理對(duì)兒茶素含量的影響不同DHPM處理壓力和次數(shù)對(duì)兒茶素含量的影響見圖3，隨著處理壓力增加，兒茶素的含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，處理次數(shù)對(duì)其含量也存在一定影響，當(dāng)處理壓力為

260 MPa，循環(huán)兩次條件下獲得的兒茶素質(zhì)量濃度最高（0.163 2 mg/mL）。未經(jīng)高壓處理的兒茶素（對(duì)照組）質(zhì)量濃度為0.146 8 mg/mL，一次處理?xiàng)l件下兒茶素的含量總體顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明一次處理對(duì)兒茶素含量影響較小，隨著處理次數(shù)的增加，兒茶素的含量基本呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。100、140 MPa條件下獲得的兒茶素含量低于對(duì)照組，然后隨著壓力的增加，兒茶素質(zhì)量濃度升高，這是因?yàn)镈HPM 的一部分能量用于扯開聚合物的長(zhǎng)鏈，當(dāng)鏈被打開后，聚合物暴露更多的非共價(jià)鍵，使其更加容易受到機(jī)械力的降解[25]；隨著處理壓力的增大，DHPM提供的剪切作用力、碰撞作用力以及空穴作用增強(qiáng)[26]，容易造成高聚原花青素分子鏈斷裂，所以兒茶素含量增加，這與梁瑞紅等[27]對(duì)于低酯果膠分子質(zhì)量降低研究結(jié)果一致。

2.3.2 DHPM處理對(duì)原花青素B2含量的影響

圖 4 DHPM處理壓力和循環(huán)次數(shù)對(duì)原花青素B2含量的影響Fig. 4 Effect of DHMP cycle and pressure on procyanidin B2content of GSPE

由圖4可知，DHPM處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素B2的含量影響較小，未經(jīng)高壓處理的原花青素B2質(zhì)量濃度為0.051 8 mg/mL，100、140、180 MPa條件下原花青素B2的質(zhì)量濃度均低于該值，隨著壓力的進(jìn)一步上升，質(zhì)量濃度有所增加，260 MPa條件下循環(huán)處理3 次獲得的原花青素B2質(zhì)量濃度最高（0.057 6 mg/mL）。可能是由于隨著處理壓力的升高，高聚原花青素解聚，其含量有所增加，但構(gòu)成高聚體中所含的原花青素B2較低，所以其含量變化不大。

2.3.3 DHPM處理對(duì)表兒茶素含量的影響

圖 5 DHPM處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素中表兒茶素含量的影響Fig. 5 Effect of DHMP cycle and pressure on epicatechin content of GSPE

由圖5可知，處理壓力和次數(shù)對(duì)表兒茶素含量影響較大，在260 MPa條件下循環(huán)處理兩次獲得表兒茶素質(zhì)量濃度最高（0.128 6 mg/mL）。未經(jīng)高壓處理的原花青素中表兒茶素質(zhì)量濃度為0.091 5 mg/mL，除140 MPa條件下處理一次，經(jīng)高壓處理的表兒茶素含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨著處理次數(shù)增加，含量總體呈先上升后下降趨勢(shì)，且隨著處理壓力增加，含量呈上升趨勢(shì)，可能是由于動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理過(guò)程中，會(huì)使高聚原花青素的氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵發(fā)生斷裂[28]，從而生成的表兒茶素含量相對(duì)較高，該結(jié)論與施雅等[29]關(guān)于金蕎麥高聚原花青素的催化氫解反應(yīng)研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了DHPM對(duì)從葡萄籽中提取得到的原花青素中兒茶素、原花青素B2和表兒茶素含量的影響。根據(jù)HPLC定量分析可知，隨著處理壓力增加，幾種物質(zhì)的含量隨之增加；隨著處理次數(shù)的增加，含量先增加后下降；不同處理?xiàng)l件下這幾種物質(zhì)的含量均存在差異，260 MPa條件下循環(huán)處理兩次，兒茶素、表兒茶素的含量最高；260 MPa條件下循環(huán)處理3 次獲得的原花青素B2含量最高。說(shuō)明隨著處理壓力和次數(shù)的變化，DHPM所提供的機(jī)械作用力增強(qiáng)，破壞高聚原花青素分子內(nèi)的非共價(jià)鍵，導(dǎo)致這幾種物質(zhì)含量增加，具體的影響機(jī)制需要進(jìn)一步分析。

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Effect of Dynamic High-Pressure Microfi uidization on the Composition of Grape Seed Proanthocyanidins

LIU Mengpei, TIE Shanshan, ZONG Wei*, ZHANG Lihua, ZHAO Guangyuan
(School of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

In this study, the effect of dynamic high-pressure microfluidization (DHPM) on the contents of catechin, procynidin B2and epicatechin in grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) was studied. The proanthocyanidins were subjected to different cycles (1–4) of DHPM at different pressures (100, 140, 180, 220 and 260 MPa) and then analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the contents of these substances increased with increasing DHPM pressures, but they rose fi rstly and then declined with increasing number of DHPM cycles. Two DHPM cycles at 260 MPa resulted in the highest contents of catechin and epicatechin (0.163 2 and 0.128 6 mg/mL, respectively) among all treatments and the highest content of procynidin B2of 0.057 6 mg/mL was obtained after three DHPM cycles. Hence, it was demonstrated that DHPM could destroy the non-covalent bonds between polymeric proanthocyanidin chains and consequently depolymerize them into oligomers and monomers with higher biological activity.

dynamic high-pressure microfluidization (DHPM); catechic; procynidin B2;epicatechic; high performance liquid chromatography chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201717027

TS201.4

A

1002-6630（2017）17-0164-04

劉夢(mèng)培, 鐵珊珊, 縱偉, 等. 高壓微射流處理對(duì)葡萄籽原花青素組分構(gòu)成的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 164-167.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717027. http://www.spkx.net.cn

LIU Mengpei, TIE Shanshan, ZONG Wei, et al. Effect of dynamic high-pressure microfi uidization on the composition of grape seed proanthocyanidins[J]. Food Science, 2017, 38(17): 164-167. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717027. http://www.spkx.net.cn

2017-03-01

河南省科技創(chuàng)新杰出人才計(jì)劃項(xiàng)目（174200510002）；河南省高?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（16IRTSHN010）

劉夢(mèng)培（1984—），女，講師，博士，研究方向?yàn)楣呒庸?。E-mail：qasd0232@163.com

*通信作者：縱偉（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸?。E-mail：Zongwei1965@126.com