新疆莎車1號扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究

李述剛，陸健康*，王 萍，馬美湖*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北工業發酵協同創新中心，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

新疆莎車1號扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究

李述剛1，陸健康2,*，王 萍2，馬美湖3,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北工業發酵協同創新中心，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

清蛋白是扁桃種仁中主要蛋白質，為揭示扁桃仁主要蛋白質組成及結構特性，以新疆莎車1號（SC-1）扁桃仁為研究對象，對其種仁中2S-清蛋白進行分離純化和結構特性研究，即經有機溶劑多次沉淀提取，獲得扁桃仁清蛋白的粗提物，再經Q Sepharose FF分離純化，獲得扁桃仁2S-清蛋白。經高效液相色譜-質譜聯用分析表明，純化后的扁桃仁2S-清蛋白準確分子質量為31.40 kD，其在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果中顯示為18.0 kD和19.5 kD 2 個條帶，表明其由兩個不同的亞基通過二硫鍵結合而成。扁桃仁2S-清蛋白中谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）的含量最高；其二級結構中主要為β-折疊，占65.9%；扁桃仁2S-清蛋白羰基含量為4.45 nmol/mg、活性巰基含量為39.95 μmol/g、總巰基含量為57.11 μmol/g、表面疏水性為23.45 μg；變性溫度為43.3 ℃。研究結果可為新疆扁桃仁的開發利用提供理論依據。

扁桃仁；2S-清蛋白；純化；結構特性

李述剛, 陸健康, 王萍, 等. 新疆莎車1號扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 36-41. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717007. http://www.spkx.net.cn

LI Shugang, LU Jiankang, WANG Ping, et al. Purifi cation and characteristics of 2S-albumin in shache No. 1 almond from Xinjiang[J]. Food Science, 2017, 38(17): 36-41. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717007. http://www.spkx.net.cn

扁桃（almond，Prunus dulcis）又名巴旦木和美國大杏仁，是樹堅果品種的重要成員，全球的主產地為澳大利亞、美國（加州）、西班牙和中國等地，是重要經濟作物之一[1]。扁桃在我國的種植主要集中于新疆，其種植面積近100萬 畝，占全國總量的90%，年產值已突破6億元，對區域經濟和社會發展起到了重要的促進作用[2]。植物種子在形成過程中會積累大量的植物蛋白質，這些植物種子為人類提供了相對廉價的蛋白質來源[3]。蛋白質在人類營養中發揮著重要的作用，人類必須通過攝入足夠的蛋白質來保證機體新陳代謝的正常進行[4]。

扁桃仁清蛋白是扁桃仁中含量最高的蛋白質，其中包含2S-清蛋白等諸多蛋白組分。目前國內對于扁桃清蛋白的研究較少，而國外對扁桃仁清蛋白的研究大多集中于其致敏性及抗原表位的鑒定等[5-6]。本研究以新疆地區新疆莎車1號（Shache-1，SC-1）扁桃仁脫脂粉為原料，采用鹽提以及有機溶劑沉淀法制備扁桃仁清蛋白粗提物，并進一步通過Q Sepharose FF離子交換層析法對其進行純化，獲得扁桃仁2S-清蛋白組分；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、高效液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLC-MS）技術、圓二色譜（circular dichroism，CD）、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法等對2S-清蛋白的分子特性進行研究，以期為深入了解扁桃仁2S-清蛋白的特性及其生物學活性提供科學依據，對該類食品的加工貯藏以及新疆扁桃開發利用和產業發展具有參考意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SC-1扁桃仁購于新疆南疆喀什地區的莎車縣扁桃農場。

Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析填料、丙烯酰胺、SDS（純度98.5%）、四甲基乙二胺（純度99%）、5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）（純度98%） 美國Sigma公司；丙酮、HCl、乙醇、乙酸乙酯（均為分析純）天津市致遠化學試劑有限公司；溴酚藍（指示劑級）、2,4-二硝基苯肼（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

756型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；FA/JA2004N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；pH211C型酸度計 北京哈納科儀科技有限公司；GL-22LM型高速冷凍離心機 湖南星科科學儀器有限公司；FD-1D-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；STA 449F3型TG-DSC熱分析系統 耐馳科學儀器商貿（上海）有限公司；ChemiDocTMXRS＋凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；715型CD儀 日本分光株式會社；L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；UHPLC LC-30A 日本島津公司；Triple-TOF 5600＋質譜儀 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取400 g成熟的扁桃仁，經攪拌器充分磨碎，然后在高速攪拌中用丙酮處理2 次（V（丙酮）∶m（扁桃仁樣品）=10∶1），由此得到蛋白質沉淀物；然后在室溫條件下，再用石油醚（m（濃縮物）∶V（溶劑）=10∶1）提取2 次，除去溶劑，在室溫條件下風干，即得扁桃仁總蛋白，并在－20 ℃貯存。

1.3.2 2S-清蛋白提取

取20 g扁桃仁總蛋白提取物，用200 mL含有0.5 mmol苯甲基磺酰氟的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）溶解，然后在磁力攪拌器中攪拌2 h（4 ℃），使其充分溶解，然后4 ℃、10 000×g離心30 min除去少量不溶物；收集上清液冷卻至0 ℃，然后添加冷甲醇，使甲醇最終體積分數達到60%，充分混合后13 500×g離心30 min；再次收集上清液，加入3 倍體積的丙酮，在－20 ℃處理16 h，然后離心，收集沉淀；將沉淀溶于水，4 ℃條件下用透析袋透析72 h，冷凍干燥，即得扁桃仁清蛋白粗提物[6]。

1.3.3 Q Sepharose FF離子交換層析

采用Q Sepharose FF作為固定相，純化的色譜條件為：先用平衡緩沖液（0.025 mol/L pH 7.5的Tris-HCl溶液）進行洗脫，洗脫體積為120 mL；再用初始濃度0 mol/L、最高濃度0.5 mol/L氯化鈉的0.025 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，洗脫液體積為600 mL；最后用2 mol/L氯化鈉、0.025mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫液體積為150 mL；洗脫處理溫度為25 ℃，流速為1 mL/min；采用自動部分收集器收集洗脫液，6 mL/管，收集后測定每管溶液的A280nm值，繪制洗脫曲線[7]。將收集得到的蛋白溶液于4 ℃截留分子質量為8 000 D的透析帶中透析72 h，每6 h更換1 次透析液。透析完畢后收集蛋白溶液，－20 ℃冷凍過夜后真空冷凍干燥，收集凍干粉于4 ℃條件下保存備用。

1.3.4 SDS-PAGE分析

制備12%分離膠、5%濃縮膠，電極緩沖液為0.05 mol/L Tris-HCl、10% SDS、0.384 mol/L甘氨酸的緩沖溶液。樣品蛋白質量濃度為2 mg/mL，上樣量為10 μL。樣品在濃縮膠中電壓為40 V，進入分離膠之后將其增至100 V。電泳完畢后染色6 h，最后脫色至背景透明[8]。

1.3.5 氨基酸組成分析

準確稱取一定量樣品（使樣品蛋白質含量在10～20 mg范圍內）于水解管中，在水解管內加6 mol/L HCl 10～15 mL，加入新蒸蒸餾水的酚酞3～4 滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，抽真空后充入高純氮氣，重復3 次后，在充氮氣狀態下封口，將已封口的水解管置于（110±1） ℃的恒溫干燥箱內水解22 h，打開水解管待水解液冷卻后過濾并轉移到50 mL容量瓶內，用去離子水多次沖洗水解管，將洗液全部轉入容量瓶內用去離子水定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶內，用真空干燥器在49～50 ℃條件下干燥，殘留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反復進行2 次，最后蒸干，再加入0.02 mol/L的HCl，溶解后用氨基酸分析儀分析[9]。

1.3.6 HPLC-MS分析

色譜條件：樣品首先通過超高效液相色譜系統UHPLC LC-30A進行分離；流動相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈溶液，色譜柱為Zorbax RRHD 300SB C3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；樣品由自動進樣器上樣，再經色譜柱分離，流速為0.3 mL/min，檢測波長214 nm，柱溫70 ℃；線性梯度范圍3%～97%乙腈。

質譜條件：液相用Triple-TOF 5600＋質譜儀進行質譜分析，分析時長為11 min，檢測方式為正離子模式，母離子掃描范圍m/z為350～4 000。

原始數據由ProMass 2.8軟件處理，參數設定：Smooth width為7，Noise threshold為2，原始質譜數據經處理后得到扁桃仁清蛋白分子質量譜圖[10-11]。

1.3.7 CD分析

參數設定：狹縫寬度為1.0 nm，響應時間為4 s，敏感度為標準模式，掃描范圍為190～250 nm，數據精度為0.1 nm，掃描速率為50 nm/min，掃描次數為2 次，樣品池長度為0.1 cm，溫度為室溫。

空白掃描：以20 mmol/L的硼酸鹽緩沖液為空白溶液；將供試品杯用2 mol/L硝酸浸泡過夜，去離子水沖洗干凈后晾干，加入20 mmol/L硼酸鹽緩沖液350 μL，按照以上參數進行190～250 nm的遠紫外掃描并采集數據，作為空白參考。

樣品測試：供試品杯清洗晾干，分別加入用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液和質量濃度為0.2 mg/mL的蛋白溶液溶解，按上述參數進行190～250 nm的遠紫外掃描并采集數據。

對掃描后的所有圖譜用軟件Jwstda 32進行Smoothing處理，然后采用Protein SSE軟件對扁桃仁清蛋白的二級結構進行擬合計算，參考標準曲線采用軟件自帶的標準α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲曲線[12]。

1.3.8 羰基含量測定

參考吳大偉等[13]測定羰基含量的方法。在1.5 mL的離心管中分別加入0.2 mL蛋白質溶液和0.5 mL的含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液，混合均勻后于20 ℃條件下水浴2 h；另取0.2 mL蛋白質溶液和0.5 mL不含有2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液混合，在20 ℃條件下水浴2 h，作為空白對照；然后分別往各離心管中加0.5 mL 40%的三氯乙酸，劇烈振蕩，搖勻后靜置20 min，10 000 r/min離心10 min后棄上清液，并用1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌沉淀3 次；將洗滌后的蛋白質沉淀懸浮于0.6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37 ℃條件下水浴30 min，測定A370nm，以不加2,4-二硝基苯肼試劑時的樣品為對照，計算每毫克蛋白質的羰基物質的量，其計算公式見式（1）。

式中：DF為樣品稀釋系數；ε為摩爾消光系數22 000 L/（mol?cm）。

1.3.9 表面疏水性的測定

將樣品溶于20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，使蛋白質量濃度為5 mg/mL。取1 mL蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍，以無蛋白的磷酸鹽溶液為對照。6 000×g離心15 min，取上清液稀釋10 倍，測定其表面疏水性用溴酚藍結合量表示，其計算公式見式（2）。

1.3.10 巰基含量測定

蛋白質活性巰基含量的測定參考許晶等[15]改進的Ellman試劑法，并做適當的調整。取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L Na2?EDTA，pH 8.0）中，再加入4 mg/mL 5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）的Ellman試劑0.1 mL，漩渦混勻后于25 ℃條件下反應15 min，測定其A412nm，以不加Ellman試劑的溶液作為對照，每組樣品測定3 次取平均值。

總巰基含量的測定：取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-甘氨酸-8 mol/L Urea-0.5% SDS溶液中，再加入4 mg/mL 5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）的Ellman試劑0.1 mL，漩渦混勻后于25 ℃條件下反應15 min，測定其A412nm，以不加Ellman試劑的溶液作為對照，每組樣品測定3 次取平均值。二硫鍵含量為總巰基含量與活性巰基含量差值的1/2。總巰基含量計算公式見式（3）。

式中：DF為樣品稀釋系數；ρ為樣品的蛋白質最終質量濃度/（mg/mL）。

1.3.11 熱性質分析

采用DSC測定扁桃分離蛋白的熱變性溫度。將8 mg左右樣品置于氧化鋁坩堝中并蓋好坩堝蓋，以空氧化鋁坩堝作為參比，氮氣作為保護氣，溫度掃描范圍為15～100 ℃，掃描速率為5 ℃/min[16]。

2 結果與分析

2.1 扁桃仁清蛋白的提取和純化

圖 1 扁桃仁清蛋白粗提物SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of crude albumin extract

經多步有機溶劑沉淀提取，獲得扁桃仁清蛋白的粗提物，為考察提取效果，對粗提物進行了SDS-PAGE分析。由圖1可知，樣品在凝膠上的條帶清晰可見，扁桃仁清蛋白粗提物在凝膠上共顯示為7 個主要的條帶，分子質量介于8～75 kD之間，依次為8、9、10、12、18.5、20 kD和63 kD，其中9、18.5 kD和20 kD 3 個條帶灰度值較高，說明這3 個條帶的組分含量高。文獻報道扁桃仁清蛋白主要包含3 個組分[17]，其分子質量與含量較高的3 個條帶一一對應，表明粗提效果較好。

2.2 陰離子交換層析純化扁桃仁2S-清蛋白圖譜及SDS-PAGE分析

Q Sepharose FF是一種流速特性好的強陰離子交換劑，具有適用性強、分離效果好等優點[18]。實驗采用Q Sepharose FF離子交換色譜純化扁桃仁2S-清蛋白，上樣質量濃度為25 mg/mL，上樣量為5 mL，結果如圖2所示。

圖 2 扁桃仁清蛋白陰離子交換層析Fig. 2 Ion exchange chromatography of crude albumin extract

由圖2可知，扁桃仁清蛋白粗提物經層析后分離為4 個主要的洗脫峰，其中洗脫峰4吸光度最高，收集峰4組分進行后續分析，該組分即為2S-清蛋白。

圖 3 扁桃仁清蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE pattern of 2S-albumin

將收集的洗脫峰4經透析脫鹽凍干后進行SDS-PAGE電泳分析。由圖3可知，經離子交換層析純化后，2S-清蛋白在電泳上僅顯示為18.0 kD和19.5 kD兩個條帶，表明其他扁桃仁蛋白質已被去除，已經得到純度較高的扁桃仁2S-清蛋白樣品。

2.3 扁桃仁2S-清蛋白分子質量

采用高分辨的質譜對扁桃仁2S-清蛋白的分子質量進行分析。純化的扁桃仁2S-清蛋白樣品，經HPLC分離后進行MS分析，通過在質譜中的離子峰測定扁桃仁清蛋白的分子質量，結果如圖4所示。

圖 4 扁桃仁2S-清蛋白的HPLC-MS圖譜Fig. 4 HPLC-MS profi le of 2S-albumin

由圖4可知，扁桃仁2S-清蛋白在質譜中表現為多個離子峰，分布范圍主要在20～50 kD之間，其中，信號強度最高的質譜峰在31 398 D處，表明扁桃仁2S-清蛋白的分子質量為31.40 kD。質譜分析測定的準確分子質量與圖3中的結果有些差異。這可能是由于扁桃仁2S-清蛋白為多亞基蛋白，在SDS-PAGE分析中，由于還原劑、變性劑和加熱處理等，使其亞基分離，因此顯示為兩個分子質量較小的條帶；而質譜分析中，處理條件較為溫和，亞基未分離，測定的為整個分子的總體分子質量，因此，兩種測定方法的結果并不一致。

2.4 扁桃仁2S-清蛋白氨基酸組成分析

采用HPLC測定純化得到的扁桃仁清蛋白氨基酸組成，共計測定16 種氨基酸，結果如表1所示。

表 1 扁桃仁2S-清蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of 2S-albumin

由表1可知，扁桃仁2S-清蛋白含所測定全部16 種氨基酸。扁桃仁清蛋白酸性氨基酸含量相對較多，其谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）含量分別達14.49%和10.05%，該結果表明扁桃仁2S-清蛋白等電點較低；此外，這些酸性氨基酸使扁桃仁2S-清蛋白含有較強的離子鍵等非共價作用力，在該蛋白提取時采用一定離子強度的弱堿性緩沖液可以更好地促進該蛋白的溶出。扁桃仁2S-清蛋白中含有較多的親水性氨基酸，這些親水性氨基酸賦予該蛋白良好的水溶性[19]。從氨基酸評分角度分析，扁桃仁2S-清蛋白第一限制性氨基酸為甲硫氨酸，第二限制性氨基酸為賴氨酸，除該兩種氨基酸外，其余必需氨基酸含量均能滿足聯合國糧農組織/世界衛生組織（Food and Agriculture Organization of the United/ World Health Organization，FAO/WHO）成人推薦標準；扁桃仁2S-清蛋白中精氨酸含量高且氨基酸組成全面，可能具有很高的生物學價值，可作為特殊食品中氨基酸膳食補充劑。

2.5 扁桃仁2S-清蛋白CD分析

對扁桃仁2S-清蛋白進行CD分析，結果如圖5所示，扁桃仁清蛋白在195～198 nm波長處有一強的正吸收峰，在205～240 nm范圍內為一個較寬的負吸收峰，α-螺旋結構的“雙負”吸收峰不明顯，說明扁桃仁蛋白二級結構中α-螺旋比例較少，以β-折疊結構為主。采用Protein SSE軟件對圖譜和標準對照品的二級結構進行擬合計算，參考標準曲線采用軟件自帶的標準α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲曲線[20]。計算結果顯示，扁桃仁2S-清蛋白的二級結構相對含量為：α-螺旋9.7%、β-折疊65.9%、β-轉角4.5%、無規卷曲19.9%。在蛋白質的二級結構中β-折疊和α-螺旋是較為有序的結構[21]，通常而言含量越高，結構越穩定，變性溫度就越高。而扁桃仁2S-清蛋白雖然含有大量的β-折疊，但是變性溫度仍較低，其可能原因是β-折疊和α-螺旋不是影響扁桃2S-清蛋白變性溫度的主要因素，而二硫鍵較少等其他原因可能是主要因素。

圖 5 扁桃仁2S-清蛋白的CD圖Fig. 5 Circular dichroism spectrum of 2S-albumin

2.6 扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團

蛋白質表面活性基團對蛋白質的理化性質具有重要影響，其中最重要的為巰基、羰基以及表面的疏水性基團。對扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團進行了測定，結果如表2所示。

表 2 扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團Table 2 Functional group contents of 2S-albumin

蛋白質羰基含量表征了蛋白質氧化的程度，吳偉等[22]研究丙二醛氧化對大米蛋白功能性質的影響時發現，丙二醛濃度為0 nmol/L時大米蛋白羰基含量為3.91 nmol/mg，而扁桃仁2S-清蛋白的羰基含量為4.45 nmol/mg，表明扁桃仁2S-清蛋白氧化程度較小。巰基和二硫鍵是維系蛋白質空間結構的重要化學鍵[23]，這些化學鍵的斷裂或者重新鍵合，將導致蛋白質高級結構發生變化，最終會對蛋白的活性和功能造成影響。扁桃仁2S-清蛋白的總巰基含量為57.11 μmol/g，活性巰基含量為39.95 μmol/g，二硫鍵含量為8.58 μmol/g，與扁桃仁清蛋白[24]相比，扁桃仁2S-清蛋白的總巰基和活性巰基含量都較低，二硫鍵亦較前者低，這可能是扁桃仁2S-清蛋白較扁桃仁清蛋白變性溫度低的原因。表面疏水性對蛋白質的乳化性和起泡性具有重要影響，扁桃仁2S-清蛋白的表面疏水性為23.45 μg，表明該蛋白表面存在一定的疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸的暴露，可以使扁桃仁2S-清蛋白蛋白具有更好的兩親特性，造成蛋白質乳化性的增加[25]。

2.7 扁桃仁2S-清蛋白熱性質分析

圖 6 扁桃仁2S-清蛋白DSC曲線Fig. 6 DSC curve of 2S-albumin

扁桃仁2S-清蛋白的DSC曲線如圖6所示。根據測定結果，扁桃仁2S-清蛋白的變性起始溫度為28.4 ℃，變性終止溫度為57.6 ℃，峰值為43.3 ℃。與扁桃仁分離蛋白相比[26]，扁桃仁2S-清蛋白的變性溫度較低，變性溫度范圍較窄，表明扁桃仁2S-清蛋白純度較高，分子一致性較高。扁桃仁2S-清蛋白變性溫度較花生2S蛋白變性溫度低，其可能的原因是扁桃仁2S-清蛋白中可形成二硫鍵的Met和Cys等硫氨基酸較少的緣故[27]。

3 結 論

本實驗以有機溶劑多次沉淀法制備扁桃仁清蛋白粗提物，經SDS-PAGE分析，該粗提物分子質量介于8～75 kD之間，其中9、18.5 kD和20 kD 3 個條帶的組分含量高；經Q Sepharose FF分離純化得到扁桃仁2S-清蛋白，經HPLC-MS分析該蛋白準確分子質量為31.40 kD，在SDS-PAGE凝膠上呈現出18.0 kD和19.5 kD兩個條帶；扁桃仁2S-清蛋白含所測定全部16 種氨基酸，其第一限制性氨基酸為甲硫氨酸，除該甲硫氨酸和賴氨酸外，其余必需氨基酸含量均能滿足FAO/WHO成人推薦標準；在CD圖上，扁桃仁2S-清蛋白在195～198 nm波長處有一強的正吸收峰，在205～240 nm范圍內為一個較寬的負吸收峰，α-螺旋結構的“雙負”吸收峰不明顯，表明其二級結構以β-折疊結構為主，含量為65.9%；扁桃仁2S-清蛋白干粉DSC曲線出現一個峰，對應的變性峰值溫度為43.3 ℃；扁桃仁2S-清蛋白羰基含量為4.45 nmol/mg、總巰基含量為57.11 μmol/g，活性巰基含量為39.95 μmol/g、二硫鍵含量為8.58 μmol/g、表面疏水性為23.45 μg。這些數據可為深入研究新疆扁桃仁蛋白質的組成、結構特性及應用提供科學依據。

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Purifi cation and Characteristics of 2S-Albumin in Shache No. 1 Almond from Xinjiang

LI Shugang1, LU Jiankang2,*, WANG Ping2, MA Meihu3,*
(1. Glyn O. Phillips Hydrocolloid Research Center, Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, School of Biological Engineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China; 2. Production & Construction Group Key Laboratory of Special Agricultural Products Further Processing in Southern Xinjiang, College of Life Sciences, Tarim University, Alar 843300, China；3. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Albumin is the major protein in almond. In this experiment, we purifi ed and structurally characterized 2S-albumin from Shache No.1 almond (SC-1) from Xinjiang. Crude albumin extract was obtained from almond by repeated precipitation with organic solvents and then fractionated chromatographically on Q Sepharose FF to obtain 2S-albumin. By HPLC-MS analysis, the accurate molecular mass of 2S-albumin was determined to be 31.40 kD, which was separated into two bands (18.0 and 19.5 kD) in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), indicating that it was composed of two distinct subunits connected through disulfide bonds. In 2S-albumin, the contents of glutamic acid, aspartic acid and arginine residues were relatively high, and its dominant secondary structure was β-sheet (65.9%). The carbonyl group content of 2S-albumin was 4.45 nmol/mg, the active thiol group content was 39.95 μmol/g, the total thiol group content was 57.11 μmol/g, the surface hydrophobicity was 23.45 μg, and the denaturation temperature was 43.3 ℃. These results can provide a theoretical support for the development and utilization of Xinjiang grown almond.

almond; 2S-albumin; purifi cation; structure characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201717007

TS255.1

A

1002-6630（2017）17-0036-06引文格式：

2017-02-14

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401644）；兵團中青年創新領軍人才項目（2016BC001）

李述剛（1979—），男，教授，碩士，研究方向為食品蛋白質化學與應用。E-mail：lishugang2010@163.com *通信作者：陸健康（1983—），男，副教授，碩士，研究方向為農產品加工。E-mail：lujiankang301@163.com馬美湖（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品蛋白質化學。E-mail：mameihuhn@163.com