抗生素微生物檢定法測定土霉素片含量的不確定度評定

李 儼，孫立麗，王婉婷

（吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 吉林 132001）

·檢驗(yàn)檢測·

抗生素微生物檢定法測定土霉素片含量的不確定度評定

李 儼，孫立麗，王婉婷

（吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 吉林 132001）

目的 分析抗生素微生物檢定法測定土霉素片含量的系統(tǒng)誤差。方法 采用容量分析法操作。結(jié)果 土霉素片的含量為(101.6± 3.4)%。結(jié)論 該方法條理清晰、簡便、準(zhǔn)確，可有效評價土霉素含量測定所帶來的不確定度，并能較好地分析其中每一個檢驗(yàn)步驟帶來的誤差，以便綜合性考慮該藥品的質(zhì)量。

抗生素微生物檢定法；土霉素；含量測定；不確定度

土霉素片的含量測定按2015年版《中國藥典（四部）》通則1201[1]“抗生素微生物檢定法”第一法(管碟法)測定，是根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價）的方法。由于管碟法的實(shí)驗(yàn)步驟較煩瑣，使用的電子天平、單標(biāo)線吸量管、容量瓶所帶來的系統(tǒng)誤差，雙碟的制備，菌液的加入量，以及鋼圈的放置，培養(yǎng)的溫度等對結(jié)果的影響都很大，因此，每一個檢驗(yàn)者得出結(jié)果后都需要評定不確定度，對于試驗(yàn)中誤差較大的儀器及量具，應(yīng)充分考慮準(zhǔn)確度及精密度。特別對于一些稍低于含量限值90.0%或稍高于110.0%的壓線結(jié)果，更要慎重對待，不僅要嚴(yán)格規(guī)范正確的操作步驟，還要評定結(jié)果的不確定度，綜合考慮試驗(yàn)所帶來的誤差，客觀評價藥品質(zhì)量[2－6]。為此，本研究中分析了抗生素微生物檢定法測定土霉素片含量的不確定度，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

R200D型電子天平，ZY－300Ⅳ型抑菌圈測定儀，SPX－250B－Z型生化培養(yǎng)箱（北京賽多利斯公司）。

1.2 試藥

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號為130305－200720）；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀為分析純，水為滅菌水；土霉素片由吉林省赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司提供，批號分別為160512，160815，161025。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備[4]

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品（約相當(dāng)于土霉素25 mg），置25 mL容量瓶中，加鹽酸液（0.1 mol／L）5 mL，振搖，使土霉素溶解后，再加滅菌水稀釋至刻度，制成每1 mL約含1 000 U的溶液，搖勻，精密量取上述溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加pH＝6.0的滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，制成100 U／mL的溶液，搖勻。分別吸取5 mL，置50 mL和25 mL容量瓶中，加滅菌緩沖液稀釋至刻度，制成10 U／mL和20 U／mL的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品4片，研細(xì)，置500 mL容量瓶中，加鹽酸液（0.1 mol／L）100 mL，振搖，使土霉素溶解后，再加滅菌水稀釋至刻度，制成每1 mL約含1 000 U的懸浮液，搖勻，靜置，精密量取懸浮液5 mL置50 mL容量瓶中，加pH＝6.0的滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，制成100 U／mL的溶液，搖勻。分別吸取5 mL，置50 mL和25 mL容量瓶中，加滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，制成10 U／mL和20 U／mL的溶液，搖勻，即得。

2.2 不確定度計(jì)算[5－7]

不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、稀釋，供試品的稀釋及測量結(jié)果平均值引入，具體公式如下：

其中，M對為標(biāo)準(zhǔn)品取樣量；f供為供試品的稀釋因子；f對為標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋因子。

2.3 不確定度分量評估

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度分量 U（m對）

使用十萬分之一天平稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，精密稱定，以天平的置信區(qū)間±0.02 mg(天平制造商給出)，按均勻分布，則由此帶來的不確定度分量（U）為0.011 5 mg。

參考《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[8]，稱量變動性（即稱量重復(fù)性）的計(jì)算公式為 0.5×精度，得0.5×0.01 mg＝0.005 mg，則由天平帶來的不確定度：

因2次稱量，故天平帶來的不確定度計(jì)算2次：

因此，則由天平帶來的相對不確定度：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋引入的不確定度分量 U（V對）

稀釋過程分原液稀釋、高濃度稀釋和低濃度稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋中使用了1個25 mL容量瓶，1個50 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管；標(biāo)準(zhǔn)品高濃度稀釋中使用了1個25 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管；標(biāo)準(zhǔn)品低濃度稀釋中使用了1個50 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管。其不確定度來源均主要包括體積校準(zhǔn)、充滿液體至刻度的變動性（重復(fù)性）、環(huán)境溫度與校正溫度不同、人員讀數(shù)4個方面。

1)50 mL容量瓶體積校準(zhǔn)帶來的不確定度

體積校準(zhǔn)：《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》[9]規(guī)定，20℃時，50 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.05 mL，計(jì)算公式：

充滿液體至刻度的變動性：根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[8]中給出的典型值，滴定管的變動性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009 2 mL，即 U2（V對50）＝0.009 2 mL。

環(huán)境溫度與校正溫度不同：實(shí)驗(yàn)溫度為25℃（水的膨脹系數(shù)為2.1×10－4／℃，p＝0.95，c＝1.96），體積變化 Δ V＝V×液體的膨脹系數(shù)×Δ T＝50 mL×2.1× 10－4×5＝0.052 5 mL，則其不確定度：

人員讀數(shù)帶來的不確定度：

因此，由50 mL容量瓶帶來的合成不確定度：

2)25 mL容量瓶體積校準(zhǔn)帶來的不確定度

參照50 mL容量瓶的方法計(jì)算，由25 mL容量瓶帶來的合成不確定度 U（V對25）＝0.105 mL。

3)由5 mL單標(biāo)線吸量管帶來的不確定度

體積校準(zhǔn)：在20℃時，5 mL單標(biāo)線吸量管（A級）的容量允差為±0.015 mL，則不確定度 U1（V對5）＝a／c＝0.008 66 mL。

充滿液體至刻度的變動性：10 mL單標(biāo)線吸量管的變動性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009 2 mL。

環(huán)境溫度與校正溫度不同：參照50 mL容量瓶的方法計(jì)算，結(jié)果為0.002 68 mL。

人員讀數(shù)：參照50 mL容量瓶的方法計(jì)算，結(jié)果為0.020 4 mL。

因此，5 mL單標(biāo)線吸量管帶來的合成不確定度：

4)標(biāo)準(zhǔn)品高濃度稀釋中25 mL容量瓶及5 mL單標(biāo)線吸量管體積校準(zhǔn)帶來的不確定度

參照上述標(biāo)準(zhǔn)品原液中的25 mL容量瓶和5 mL單標(biāo)線吸量管的方法計(jì)算，結(jié)果 Urel（f對高）＝0.006 39。

5)標(biāo)準(zhǔn)品低濃度稀釋中50 mL容量瓶及5 mL單標(biāo)線吸量管體積校準(zhǔn)帶來的不確定度

參照上述標(biāo)準(zhǔn)品原液中的50 mL容量瓶和5 mL單標(biāo)線吸量管的方法計(jì)算，結(jié)果不確定度：

2.4 供試品稀釋引入的不確定度分量 U（V供）

稀釋過程分原液稀釋、高濃度稀釋和低濃度稀釋。供試品原液稀釋中使用了1個500 mL容量瓶，1個50 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管；供試品高濃度稀釋中使用了1個25 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管；供試品低濃度稀釋中使用了1個50 mL容量瓶和1個5 mL單標(biāo)線吸量管。參照標(biāo)準(zhǔn)品稀釋引入的不確定度分量 U（V對）的方法計(jì)算，結(jié)果 Urel（f供原）＝0.007 59。

采用與標(biāo)準(zhǔn)品高濃度和低濃度同樣的方法稀釋，同理得出：

2.5 測量結(jié)果平均值帶來的相對不確定度分量 Urel（P）

本試驗(yàn)獨(dú)立測量2次，含量值分別為101.66%和101.59%。求出 P＝101.62%，Si＝0.049 5%。結(jié)果平均值帶來的不確定度：

平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.7 擴(kuò)展不確定度

2.8 報告結(jié)果

3 討論

抗生素微生物檢定法使用活菌檢測，存在很多不確定性，同時操作點(diǎn)樣也存在很多人為因素，每一步都容易導(dǎo)致結(jié)果的不確定性[10]。因此，考察土霉素片含量的不確定度是非常必要的，通過對不確定度的來源、分量進(jìn)行評估，分析由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。反過來，也表明該結(jié)果的可信賴程度。不確定度是測量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)。不確定度愈小，所述結(jié)果與被測量的真值愈接近，質(zhì)量越高，水平越高，其使用價值越高；反之，結(jié)果的質(zhì)量與價值也越低。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有異議的或邊緣值有必要做不確定評估。按藥典規(guī)定，抗生素微生物檢定法可信率一般不得大于5%。誤差分析中，以前用測量誤差來表述測量不確定度，現(xiàn)在的定義更準(zhǔn)確，是指測量所獲得結(jié)果的不確定的程度。

實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，測量不確定度的來源有幾個方面：取樣的代表性不夠；對環(huán)境條件的測量與控制不完善；對模擬儀器的讀數(shù)存在人為偏移；測量儀器的分辨力或鑒別力不夠；測量方法和測量程序人近似性和假定性。經(jīng)評估，測定土霉素片的含量時，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程帶來的誤差最大。要減小其不確定度，研磨時應(yīng)注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內(nèi)含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時量取供試溶液應(yīng)讀取輔料下層的溶液切面，如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；另外，一些輔料會吸附抗生素，應(yīng)加以注意。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：160－165.

[2]王麗楠，楊美華，陳建民.不確定度分析在藥物研究中的應(yīng)用[J].中草藥，2008，39（3）：464－467.

[3]劉新榮，肖輝川，蘇敬武，等.衛(wèi)生檢驗(yàn)工作中測量不確定度的評定[J].現(xiàn)代測量與實(shí)驗(yàn)室管理，2005，13（4）：22－26.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·抗生素藥品(第一冊)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1989：4－5.

[5]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司.測量不確定度評定與表示指南[M].北京：中國計(jì)量出版社，2001：46－52.

[6]臧慕文.分析測試不確定度的評定與表示（I）[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2005，24（11）：74－79.

[7]佘偉鳴.藥品檢驗(yàn)中測量不確定度的評定[J].中國新藥雜志，2003，12（9）：775.

[8]中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南[M].北京：中國計(jì)量出版社，2002：26－32.

[9]JJG196－2006，常用玻璃儀器檢定規(guī)程[S].

[10]陸 明，范國榮，汪 楊，等.測量不確定度在藥品領(lǐng)域的應(yīng)用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（8）：1053－1057.

Evaluation of Uncertainty in Content Determination of Terramycin Tablets by M icrobiological Assay of Antibiotics

Li Yan，Sun Lili，Wang Wanting
（Jilin Institute for Food and Drug Control，Jilin，Jilin，China 132001）

Objective To analyze the systematic errors in the determination of Terramycin Tablets by microbiological assay of antibiotics.M ethods The volumetric analysis was adopted.Results The content of Terramycin Tablets was（101.6±3.4）%.Conclusion The method is clear，simple and accurate，it can effectively evaluate the uncertainty caused by the content determination of terramycin，and can well analyze the errors caused by each inspection step in the determination of terramycin content，so as to comprehensively consider the quality of the drug.

microbiological assay of antibiotics；terramycin；content determination；uncertainty

R927.1

A

1006－4931(2017)16－0026－03

2017－03－15；

2017－05－03)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.16.008

李儼，女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)新方法及標(biāo)準(zhǔn)提高，（電子信箱）1876702723＠qq.com。