阿爾茨海默病患者淋巴細胞中雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶水平與認知障礙的相關性

生曉娜, 李瀟瀟， 張曉煒， 王 珊， 季 光， 鄭為娜， 張國華

阿爾茨海默病患者淋巴細胞中雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶水平與認知障礙的相關性

生曉娜1, 李瀟瀟3， 張曉煒2， 王 珊1， 季 光1， 鄭為娜1， 張國華1

目的 研究雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者外周血淋巴細胞(Peripheral lymphocytes，PBLs)中的表達及活性；探討其水平及活性改變與AD患者認知障礙的相關性。方法 選取AD、PD及健康老年人各20例，應用蛋白質免疫印跡技術檢測PBLs中總PKR及磷酸化PKR(p-PKR)的表達，分析比較3組中PKR表達及活性的差異,并利用皮爾森相關分析探討PKR表達及活性與AD、PD病程和病情的關系。結果 與正常對照組相比，總PKR、p-PKR蛋白表達水平在AD患者的PBLs中均明顯升高(P<0.05)，且總PKR的表達量與AD患者認知障礙嚴重程度呈正相關(r=0.799，P<0.01)；在PD組PBLs中總的PKR與p-PKR蛋白水平均升高(P<0.05)。結論 在AD患者中，PKR的異常表達及活化不僅體現在中樞神經系統，而且可在PBLs中檢測到，其表達量與認知障礙嚴重程度成正相關，有可能成為AD早期診斷及病情評價的外周標記物。

PKR； 阿爾茨海默病； 外周血淋巴細胞； 認知障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是發生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變，是老年期癡呆的最常見類型，主要表現為進行性全面認知功能損害。隨著人口老齡化進程，阿爾茨海默病發病率逐年上升,嚴重影響患者的生活質量，也給家庭和社會帶來了沉重的生活和經濟負擔。

目前國內外在AD領域的研究多為動物實驗或尸檢后研究神經元的受損情況。然而，早期診斷AD是制定治療策略、控制疾病進程的基礎及關鍵。近期研究表明，在AD中細胞凋亡、細胞周期調控的失衡不僅局限于神經元，而且體現在外周血淋巴細胞。外周血采集方便，易于檢測，深入研究可能對臨床AD的早期診斷及治療具有重要意義，但至今尚無這樣的標志物為臨床所應用。

雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在信號轉導、應激、細胞生長、分化和凋亡調控中起重要作用,是阿爾茨海默病調節的關鍵靶點，已有研究證實在神經變性疾病患者的中樞神經系統中可檢測到PKR的異常表達及活化。因此，研究其是否可作為與認知功能減退相關的外周血生物學標記物具有可行性和必然性。

據此，本研究擬通過測定AD患者外周血淋巴細胞中PKR的蛋白表達和活化水平，以帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者和同期健康體檢者為對照組進行統計分析，探討外周血淋巴細胞中PKR水平與AD、PD的關系及病情進程的相關性，為進一步研究方便有效的AD外周標記物和潛在的治療靶點提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)AD組：系2010年-2011年我院神經內科門診就診的20例輕至中度AD患者，其中男7例，女13例；年齡55～72歲，平均年齡(66.75±7.79)歲；病程0.5～4 y，平均病程(2.07±1.72)年；簡易精神狀態檢查(minimental state examination，MMSE)評分在14～18分，平均(15.75±4.16)分；臨床癡呆量表評分(Clinical dementia rating，CDR)≦2。入組AD患者均符合美國國立神經病、語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關疾病協會(the national institute of neurological and communicative disorders and stroke and the Alzheimer’s disease and related disorders association,NINCDS-ADRDA)的很可能AD的診斷標準，且無家族史。(2)PD組：系2010年-2011年就診本院神經內科門診的PD患者20例，其中男8例，女12例；年齡52～71歲，平均年齡(64.22±9.23)歲；病程1～4 y，平均病程(2.57±1.05)y；均符合2006年中華醫學會公布的PD診斷標準，且已排除認知功能障礙。(3)健康對照組：系本院同期健康體檢者20例，其中男8例，女12例；年齡55～73歲，平均年齡(65.45±7.73)歲，年齡和性別構成比與病例組相比無明顯差異,經神經心理學檢查認知功能正常。

所有入選對象均排除患有嚴重心、肝、腎及其它全身性系統性疾病、腦卒中病史、精神系統疾病、手術史、外傷史和其它重大疾病史。家族中均無癡呆患者。所有入選患者及健康體檢者均由其本人或監護者簽署知情同意書，并提供血樣，過程符合人權及人道主義和醫學倫理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 所有受檢者均于上午9：00～11：00抽取10 ml靜脈新鮮抗凝血，用人淋巴細胞分離液分離、收集淋巴細胞， PBS緩沖液洗滌獲得淋巴細胞。

1.2.2 提取總蛋白 蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合液加入裂解-結合緩沖液重懸淋巴細胞，加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。以上過程除干燥外均在4 ℃條件下完成。加入2%十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液，95 ℃水浴溶解沉淀，離心去除不溶物。

1.2.3 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測PKR、p-PKR水平 用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白(100 μg)進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，然后恒流下將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉后，加入相應的一抗(PKR抗體、p-PKR抗體、GAPDH)4 ℃過夜；過夜后加入相應的二抗，室溫孵育。采用Odyssey System對圖像進行定量分析。

2 結 果

2.1 AD組與正常對照組total-PKR、p-PKR蛋白水平的比較 與正常對照組相比，total-PKR及p-PKR在AD患者的外周血淋巴細胞中蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)(見圖1、表1)。

2.2 PD組與正常對照組total-PKR、p-PKR蛋白水平的比較 與正常對照組相比，在PD患者的淋巴細胞中，total-PKR蛋白表達水平顯著升高，有統計學意義(P<0.05)；p-PKR蛋白表達水平亦升高(P<0.05)(見圖1、表1)。

2.3 PKR與AD病程及病情的關系 經Pearson相關分析得出，total-PKR蛋白表達水平及活化與AD患者MMSE評分呈正相關：(1)total-PKR/GAPDH與MMSE評分：r=0.799，P<0.01;(2)p-PKR/total-PKR與MMSE評分：r=0.674，P<0.05。與病程未見相關P>0.1(見圖2)。

表1 外周血淋巴細胞中total-PKR、p-PKR蛋白水平在3組間的比較

與正常對照組相比差異有統計學意義*P<0.05

圖1 total-PKR、p-PKR在正常對照組、AD組及PD組外周血淋巴細胞的Western-blot檢測結果

圖2 A：total-PKR蛋白表達水平與AD患者MMSE評分的相關性分析r=0.799，P<0.01；B：p-PKR蛋白表達水平與AD患者MMSE評分的相關性分析r=0.674，P<0.05

3 討 論

凋亡，作為細胞信號轉導的明確機制之一，在神經系統變性疾病的發生發展過程中發揮著重要作用。細胞凋亡是AD神經元死亡的最主要形式，其與細胞周期有著緊密的聯系，因而細胞周期重啟的失調逐漸為人們研究AD中神經元死亡提供了新視角。雙鏈RNA-依賴的蛋白激酶-PKR，分子量68 kD，為保守雙鏈RNA結合分子家族成員。細胞中的PKR主要分布在細胞質，小部分散在分布于核漿。研究表明[1]，低濃度的dsRNA具有活化PKR的作用，而高濃度的dsRNA卻抑制該活化作用。激活的PKR通過促使轉錄因子NF-κB活化，促進凋亡相關基因的轉錄和表達，啟動細胞凋亡程序。其次，PKR和P38/MAPK通路之間有確定的聯系，PKR可以通過IKK和P38途徑影響NF-κB通路上基因的轉錄，誘導凋亡，但是這一過程內在復雜的路徑仍需進一步研究[2,3]。再次，IL1、TNF、dsRNA、LPS、IFNs等應激相關信號分子都通過PKR來激活NF-κB通路，啟動凋亡程序。如果沒有PKR的活化，NF-κB通路雖然能繼續作用，但是其作用強度會減弱[2,4]。細胞周期蛋白的起始翻譯和調控參與記憶的形成，它包括兩條通路：mTOR和PKR。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K/Akt信號通路下游的激酶，與GSK3β并駕齊驅，PKR為聯系二者的中間調節激酶。同時，P53也可以在分子水平聯系PKR信號通路和mTOR信號通路[1]。

這些研究結果都表明，PKR參與多條信號轉導通路，其中很多傳導通路和信號因子經研究已證實與神經變性疾病密切相關。所以，研究PKR在以阿爾茨海默病為主的神經變性病中的表達具有現實意義和可行性。最新的研究表明，在AD中，凋亡和細胞周期失調不僅局限于中樞神經元，而且存在于外周細胞[5]；與此同時亦有研究顯示PKR蛋白表達水平與PD和HD(亨廷頓病)患者海馬區的神經元缺失有關[6,7]。

據此，本研究檢測了正常對照者、AD和PD患者外周血淋巴細胞中total-PKR與p-PKR的蛋白水平。結果顯示，相較于正常對照組，AD患者淋巴細胞中total-PKR及其活化形式p-PKR水平均顯著升高，結果與Julien Couturier等[8,9]在動物實驗及尸檢中觀察到AD大腦海馬PKR活性增高相一致，這表明PKR蛋白水平的改變不僅發生在中樞神經元，而且存在于外周血淋巴細胞，可能為AD患者所特有的系統性表現之一，極有可能成為用于AD診斷的外周標記物。但是，近來人們對PKR在腦組織中的表達水平的研究存在爭議，國外有動物實驗和尸檢表明[10]p-PKR在AD轉基因小鼠和患者大腦中表達明顯增加，而總的PKR表達不增加或減少。對于這樣的結果，我們認為與人種、遺傳學、方法學上的差異有關，并且PKR在外周血淋巴細胞中的表達與在腦組織細胞中的表達，存在一定的差別。總的來說，有一點大家的看法是一致的：PKR水平與神經退行性疾病特別是阿爾茨海默病相關。

本次實驗結果提示，AD患者外周血淋巴細胞與神經元在凋亡和細胞周期調控機制上可能存在相同的缺陷，這為研究其機制和潛在的治療靶點提供了一種可行、方便的外周細胞模型。

此外，我們的結果表明AD患者淋巴細胞中PKR的蛋白水平及活化與認知障礙嚴重程度呈正相關。MMSE評分越低，外周血淋巴細胞中PKR的表達水平及活化也就越高。

在本實驗中，我們發現PD患者外周血淋巴細胞中PKR蛋白表達水平較正常對照組升高，但是由于目前關于PKR和PD的研究很少，因此本結果提示作為神經變性疾病，在PD中，凋亡及其調控通路的改變可能不僅局限于中樞神經元，同樣存在于外周血。

凋亡是神經變性疾病最主要的病理機制之一，PKR在AD動物模型和尸檢中雖然有一定的研究，然而鮮見其在人外周血淋巴細胞中的研究，在PD外周血淋巴細胞中的研究國內外未見報道。此外，不加干預、直接檢測其中的激酶含量在國內未見報道。本次實驗結果表明AD患者淋巴細胞中PKR的表達水平及磷酸化水平均顯著升高，并且PKR在淋巴細胞的表達水平及其活化與AD患者的疾病嚴重程度密切相關。這些發現提示PKR或可做為一條信號通路中的一點或多條信號通路的聯絡點與其他蛋白或蛋白激酶一起聯合用于AD患者早期外周血標志物的檢測，從而成為研究AD、PD的另一可行手段，用于病情的早期診斷及評價，并且由于它的廣泛表達及便于檢驗而應用于疾病的人群篩查。

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The relationship between cognitive impairment and the double stranded RNA-dependent protein kinase level in peripheral lymphocytes of Alzheimer’s disease

SHENG Xiaona,LI Xiaoxiao,ZHANG Xiaowei,et al.

(Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，Key Laboratory of Hebei Neurology,Shijiazhuang 050000,China)

Objective To investigate PKR and its activated status levels of expression in peripheral lymphocytes (PBLs) of Alzheimer’s disease(AD),and to discuss the relationship of this change and cognitive disfunction.Methods Healthy control,AD and PD were set up,containing 20 cases respectively.PKR and phospholated PKR (p-PKR) levels of expression in lymphocytes were detected by Western blotting and the changes of total and activated PKR levels were analyzed in three groups.The relationships of PKR and p-PKR expression levels and diseases durations and severities of AD and PD were discussed by Pearson’s correlation analysis.Results Both total PKR and activated status levels were augmented in PBLs of AD patients compared with controls (P<0.05) and total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity (r=0.799，P<0.01).Both PKR and p-PKR levels were increased in lymphocytes of PD patients compared with controls (P<0.05).Conclusion The abnormal expressions of PKR and p-PKR were not only in central neurological system but also in PBLs.Total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity of AD patients.Thus PKR may be a potential peripheral biomarker in early diagnosis and cognitive function estimations during AD processes.

PKR; Alzheimer’s disease; Peripheral lymphocytes； Cognitive impairment

2017-04-23；

2017-05-30

河北省重點研發自籌項目(科技惠民工程)(No.162777151)；河北省自然科學基金資助項目(No.H2017206156)

(1.河北醫科大學第二醫院神經內科；河北省神經病學重點實驗室,河北 石家莊 050000; 2.河北醫科大學第二醫院神經外科,河北 石家莊 050000；3.北京四季青醫院神經內科,北京 100097)

張國華,E-mall:zhangguohua1983@sina.com

1003-2754(2017)08-0692-04

R749.1

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