甲狀腺癌復發與BRAF基因突變的關系研究

宋傳偉

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.16.019

[摘要] 目的 探討BRAF基因突變與甲狀腺癌復發之間的關系。方法 方便選擇2014年4月—2015年4月期間該院收治的復發性甲狀腺乳頭狀癌患者22例（復發組）的復發灶和原發灶標本為研究對象，再選擇同期收治的無復發生存的甲狀腺癌患者21例為對照組，分別對兩組的BRAF基因進行測序，對T1799A位點的V600E突變情況進行觀察。結果 復發組中復發病灶與原發病灶BRAF基因T1799A位點V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的復發灶BRAF基因為野生型，而原發灶為突變型；同時，對照組的BRAF基因1799A位點V600E突變率為22.73%（5/22）；兩組的BRAF突變率比較差異有統計學意義（P<0.05）。結論 甲狀腺癌復發與BRAF基因突變有關，BRAF基因突變患者術后更容易出現復發，并且原發灶基因表型與復發灶不一致。

[關鍵詞] BRAF基因突變；復發；甲狀腺癌

[中圖分類號] R736 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）06（a）-0019-03

Research on Correlation between the Recurrence of Thyroid Cancer and BRAF Gene Mutation

SONG Chuan-wei

Department of Breast and Thyroid Surgery， Heze Municiple Hospital， Heze， Shandong Province， 274000 China

[Abstract] Objective To discuss the correlation between the recurrence of thyroid cancer and BRAF gene mutation. Methods The recurrence lesions and primary lesions specimens of 22 cases with papillary thyroid carcinoma admitted and treated in our hospital from April 2014 to April 2015 were selected and 21 cases of patients with thyroid carcinoma without recurrence admitted and treated in our hospital at the same period were selected as the control group， and the BRAF gene was sequenced， and V600E mutation at T1799A was observed. Results The V600E mutation rate at T1799A locus of recurrent lesions and primary lesions BRAF in the recurrence group was respectively 50.00%（11/22）and 60.00%（12/20）， and the recurrent lesion of BRAF gene of 1 case was wild type， but the primary lesion was mutation， at the same time， the V600E mutation rate at 1799A locus in the control group was 22.73%（5/22）， and the difference in the BRAF mutation rate between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The recurrence of thyroid cancer is related to the BRAF gene mutation， and the patients with BRAF gene mutation are easy to reoccur， and the gene phenotypes of primary lesions are not consistent with recurrent lesions.

[Key words] BRAF gene mutation； Recurrence； Thyroid cancer

甲狀腺癌是比較常見的一種甲狀腺惡性腫瘤，在全身惡性腫瘤中占有較高的比例，約為1%～3%左右，并且在頭頸部腫瘤中具有較高的發病率，居于首位，常見癥狀有吞咽困難、聲音嘶啞以及腫塊等，不僅危害患者健康，還嚴重影響患者的正常生活和工作。當前臨床上在治療甲狀腺癌時，有多種多樣的方法，包括放射性核素治療、內分泌治療以及手術治療等，大多數甲狀腺癌患者可以獲得較好的預后，但是少數患者術后會出現復發，并且預后較差。BRAF因子作為Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導通路的一個重要轉導因子，長約190kb，位于人染色體7q34，通過絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶發揮作用，該酶通過ERK、MEK以及核內轉錄因子與細胞表面的RAS蛋白和受體相連接，啟動多種因子，對細胞內多種生物學事件進行調控，包括細胞凋亡、分化以及生長等，有研究發現[1]，BRAF在甲狀腺癌的高、中、低分化中具有較高的陽性表達率，并且腫瘤分化程度與其表達呈正比關系，可以作為判斷患者預后的一個重要指標。因此，該文研究了2014年4月—2015年4月期間該院收治的復發性甲狀腺乳頭狀癌患者22例與BRAF基因突變之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇該院收治的復發性甲狀腺乳頭狀癌患者22例（復發組）為研究對象，年齡22～80歲，平均（50.3±18.5）歲，其中15例為女性、7例為男性；再選擇同期收治的21例無復發生存的甲狀腺癌患者為對照組，其中8例為男性、13例為女性，年齡23～76歲，平均（50.1±18.6）歲。入選標準：①符合甲狀腺癌診斷標準，且經病理學檢查確診；②經醫院倫理委員會批準；③患者自愿參與，且簽署同意書；④無重大內科疾病史、頭頸部腫瘤病史以及術前治療史。排除標準：①嚴重精神異常或意識障礙者；②不愿意參與研究者；③哺乳期或妊娠期婦女；④臨床資料不完善者。兩組的性別比、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 檢測BRAF基因T1799A位點突變

將上述蠟塊送至上海生物醫藥公司進行純化處理后，運用聚合酶鏈反應進行擴增，然后直接測序，并且對比分析BRAF基因組DNA正常序列與所得結果，判斷是否存在點突變。

1.2.1 提取DNA 按照常規方法，碾碎上述所取蠟塊標本，對DNA進行提取，并且在-20°C條件下保存提取的DNA以備用。

1.2.2 PCR擴增目標片段 ①引物設計。選擇上海生物醫藥公司合成的引物，引物序列如下：反向引物為5-GGCCAAAAAT-TTAATCAGTGGA-3，正向引物為5TCATAATGCTTGC-TCTGATAGGA-3，目標片段擴增后長度為224 bp。②PCR反應體系。通常情況下，PCR反應條件為：59.1°C退火30 s，94°C預變性3 min，72°C延伸30 s，94°C變性30 s，連續35個循環，然后在72°C中進行8min延伸后結束。PCR反應體系：17.8μl雙蒸水，2.5 μL擴增緩沖液（含Mg2+）×10，正向引物和反向引物各0.5 μL（20 μmol/L），1.5 μlDNA模板，0.2 μL（5 U/μL）Tap DNA聚合酶，2.0 μL（10 mmol/L）dNTP，總體積為25 μL。

1.2.3 電泳檢測PCR產物 為了確定PCR產物中存在目標DNA片段，在1.0 μL DNA加樣緩沖液中加入5 μLPCR產物中均勻混合后加樣，然后選擇1.0 μL DNA標記物作為分子對照，在6%聚丙烯酰胺凝膠中進行AgNO3染色并行電泳。

1.2.4 PCR產物測序 在電泳檢測中，確定為PCR產物后，將其送至上海生物醫藥公司進行純化并測序，對比分析BRAF基因組DNA正常序列與所得結果，判斷是否存在點突變。

1.3 統計方法

運用SPSS 15.5統計學軟件分析數據，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

復發組中復發病灶與原發病灶BRAF基因T1799A位點V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的復發灶BRAF基因為野生型，而原發灶為突變型；同時，對照組的BRAF基因1799A位點V600E突變率為22.73%（5/22）；兩組的BRAF突變率比較差異有統計學意義（χ2=9.273，P<0.05）。

3 討論

近年來，甲狀腺癌在我國的發病率呈現出明顯的上升趨勢，不僅影響患者的正常生活，已經成為危害社會公眾健康的一種重要疾病。通常情況下，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在臨床上又被稱之為細胞外信號調節激酶，是MAPK信號傳導通路的一個下游蛋白激酶，在腫瘤的發生、發展以及轉移過程中發揮著極其重要的作用。有研究發現，MAPK通路串聯激酶的激活與70%甲狀腺癌有關，并且濾泡狀腺癌、甲狀腺腺瘤與RAS基因突變有關，而甲狀腺乳頭狀癌（PTC）與BRAF基因突變和染色體重組致癌基因融合有關，并且散發性成年人PTC具有較高的BRAF基因突變率，尤其是BRAF T1799A突變熱點[2]。一般來說，在甲狀腺單發結節患者中，惡性結節所占比例較低，約為5%～8%左右，所以大部分甲狀腺結節不需要行手術治療，當前在鑒別診斷甲狀腺良、惡性結節時，甲狀腺FNA細胞學檢查作為一個金標準，但是在應用的過程中，容易受到諸多因素如采集細胞數等影響，約30%結節無法準確診斷，只有行手術切除活檢才可以確診。因為BRAF基因突變作為PTC比較常見的一個分子遺傳學改變，即使是微小的PTC也能檢出，而良性病變組織和正常甲狀腺組織中不存在這一基因突變，所以對BRAF基因突變進行檢測，有助于鑒別和診斷甲狀腺良惡性結節。臨床研究資料表明，甲狀腺乳頭狀癌的發生和發展作為多步驟、多基因的一個過程，在RET/PTC-RAS-RAF-MARK途徑中，基因突變占有較高的比例，約為80%左右，其中BRAF具有較高的基因突變率，為44%，并且有文獻報道，BRAF突變型甲狀腺乳頭狀癌具有較強的組織侵襲力，容易對甲狀腺周圍組織產生浸潤，臨床分期晚，預后差[3]。在該次研究中，復發組中復發病灶與原發病灶BRAF基因T1799A位點V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），明顯高于對照組的BRAF基因1799A位點V600E突變率為22.73%（5/22），陳小麗等[4]在研究中發現，健康對照組的BRAR基因1799位點V600E突變率為24.00%（6/25），明顯低于觀察組的65.00%（16/25），這一結果與該次研究報道相符，說明BRAF基因突變是導致甲狀腺癌復發的一個重要因素。有研究發現，BRAF基因突變是誘發MAPK信號通路異常激活的一個重要因素，當前發現的BRAF基因突變類型已經超過40種，其中T1799A位點的V600E變異比較常見，但是腫瘤的惡性行為是否與BRAF突變有關，臨床上還存在著一定的爭議。近年來，Riescoeizaguirre等[5]在研究中發現，碘代謝基因的低表達與BRAF基因突變有關，說明部分分化型甲狀腺癌放療中的“碘抗拒”與BRAF有關。同時，通過將MAPK信號通路激活，BRAF基因V600E點突變的致癌作用較強，能夠誘發淋巴結轉移、惡變細胞包膜浸潤等[6]。而Knauf等[7]在研究中發現，BRAF基因V600E突變的甲狀腺乳頭狀癌患者術后更容易殘留癌組織，并且具有較高的風險，與該次研究報道一致。此外，原發灶與復發腫瘤作為單細胞克隆，其分子表型應該相同，但是在研究中發現，甲狀腺乳頭狀癌復發轉移灶的受體表型容易發生變異，還需要更深入研究[8-11]。

綜上所述，BRAF基因突變與甲狀腺癌復發密切相關，并且BRAF基因突變患者術后的復發風險較高]，臨床上應該重視基因分型診斷，有助于判斷患者預后。

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（收稿日期：2017-03-09）