不同水解度下的大豆分離蛋白的結構表征

劉軍，黃文秀，劉汝萃，牛祥臣，李成輝，王吉龍

（山東禹王生態食業有限公司，山東禹城251200）

不同水解度下的大豆分離蛋白的結構表征

劉軍，黃文秀，劉汝萃，牛祥臣，李成輝，王吉龍

（山東禹王生態食業有限公司，山東禹城251200）

利用中性蛋白酶水解大豆分離蛋白（SPI），并通過熒光探針法、SGS-PAGE凝膠電泳及掃描電鏡技術對不同水解度（DH）下的SPI的疏水性進行分析，且對其二級結構和微觀結構變化進行表征。結果表明：隨著水解度的增加，SPI的表面疏水性呈增長趨勢。通過不同DH下制備的SPI的電泳分析，隨著DH的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同DH下的SPI的多肽與亞基分布相似，隨著DH的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，新增的聚集肽含量增多。不同DH下的SPI，皆呈單個球狀蛋白分布，分布較為松散，每個球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態，隨SPI的DH增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

大豆分離蛋白；水解度；表面疏水性；結構表征

蛋白可分為植物蛋白和動物蛋白，其中大豆蛋白是含量最為豐富的優質蛋白質之一[1-2]，具有以下幾點優勢：1）大豆蛋白含有人體所需的8種必需氨基酸，且比例合理，皆符合WHO的標準；2）我國生產大豆，因此大豆蛋白來源廣泛，價格相對低廉；3）大豆蛋白為天然植物蛋白，不含膽固醇，并且符合人體健康的需求；4）大豆蛋白具有優良的乳化性、發泡性和凝膠性，是食品工業應用的重要蛋白質。但大豆蛋白由于其分子量大、溶解度低、含有抗營養因子以及具有抗原性等因素而大大限制了大豆蛋白產品的應用領域[3]。目前針對大豆蛋白的改性研究則比較集中于化學方法和酶改性方法。但在化學方法改性的過程中會添加一些化學試劑，因此不能直接用于食品中；蛋白質酶促水解是在水溶液中通過酶的催化作用，使蛋白質中的肽鍵斷裂，生成胨、肽等低分子量產物的生化反應過程。蛋白質經酶水解有助于改善其營養價值和功能性質，從而拓寬其應用范圍。大豆蛋白水解能改善溶解度、乳化性、起泡性等功能性質以及降低過敏性，產品能應用于乳制品、肉類、飲料以及嬰兒食品中，在食品蛋白質配料加工方面有著特殊意義[4-7]。

本研究采用中性蛋白酶對大豆分離蛋白進行酶解，測定其水解度與蛋白表面疏水性關聯曲線，通過SDS-PAGE凝膠電泳與掃描電鏡對酶解后的大豆分離蛋白的結構和微觀結構進行表征，旨在更好了解中性蛋白酶水解大豆分離蛋白的機理，并為開發大豆分離蛋白酶解產物提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東禹王生態食業有限公司；中性蛋白酶：（100 000 U/g，杰能科生物工程有限公司，中國）被保存于-4℃。其它試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設備

F-4500熒光分光光度計、SN-3400掃描電鏡：日本日立公司；DYY-8C電泳儀、DYY-8C電泳槽：北京市六一廠；Gel k8160凝膠成像分析系統：北京鴻濤基業科技發展有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；868型pH計：上海熱電儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活測定

利用GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》中蛋白酶活力的測定方法，采用福林酚法測定蛋白酶活力，酶活力單位為U/mL。

1.3.2 中性蛋白酶水解大豆分離蛋白

經李和平[8]等的方法稍作修改后，利用中性蛋白酶對SPI進行水解。稱取20 g SPI溶于蒸餾水中，使其底物濃度為5%，于90℃水浴鍋中預熱10 min，用1 mol/LNaOH調節溶液pH值至7.0，溶液冷卻至45℃，加入0.8%（質量分數）中性蛋白酶，于45℃水浴鍋中恒定pH值7.0緩慢攪拌一定時間。將水解后溶液置于90℃水浴中滅酶20 min，冷卻至室溫后，加蒸餾水稀釋剪切后進行噴霧干燥，得到酶解大豆分離蛋白。

1.3.3 水解度測定

將SPI經水解后得到的溶液采用Alder-Nissen方法進行水解度測定[9]。水解度被定義為被破壞的肽鍵數（h）占單位重量總肽鍵數（htot）的百分比，通過加入的NaOH維持pH值恒定的量計算水解度，計算公式如下式（1）所示：

式中：B為維持水解時的pH值恒定的NaOH體積數，mL；Nb為常量；Mρ：蛋白質質量（g，%N×6.25）；1/α為pH-stat方法的校準因子；htot：肽鍵含量。

1.3.4 表面疏水性測定

經Seronei方法稍作修改[10]后，對SPI樣品進行表面疏水性測定。用1-苯胺-8奈（ANS）作為熒光探測劑。用磷酸緩沖液稀釋（0.01 mol/L，pH7.0）稀釋酶解后的SPI樣品為不同濃度（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%），用0.01 mol/L pH值為7.0的磷酸緩沖溶液配制成8.0 mmol/L的ANS，并將20 μL ANS與酶解后的SPI樣品溶液混合，于激發波長390 nm和發射波長470 nm測定熒光強度（FI）。以熒光強度對蛋白濃度作圖，回歸曲線的初始斜率為表面疏水性。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

將不同水解度下的SPI樣品與Tris緩沖溶液（0.06 mol/L，pH 6.8）混合，其中含β-巰基乙醇（體積分數 5%）、甘油（25 g/100 mL）、SDS（2 g/100 mL）、溴甲酚藍（0.1 g/100 mL），于沸水浴中加熱5 min后用于SDSPAGE凝膠電泳分析。

該SDS-PAGE凝膠電泳采用3層不連續膠的混合使用，即分離膠＋夾層膠＋濃縮膠結構，此3層膠皆由不同比例組成的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液聚合形成。凝膠的配制方法如表1所示。

表1 分離膠、夾層膠和濃縮膠的組成Table 1 Composition of separating gel，laminated gel and concentrate gel

分離膠、夾層膠和濃縮膠的膠體積比為4∶1.5∶1（體積比）。電泳時，先將電壓調至80 V，待指示前沿到達分離膠時，把電壓調至120 V，直至電泳結束。電泳結束后，將膠片染色12 h（考馬斯亮藍R-250染色液：42%的95%乙醇和10%冰乙酸，0.1 g）。染色結束后用脫色液（包含7%甲醇，30%冰乙酸）洗脫膠片，直至蛋白質條帶變為清晰為止。并采用凝膠成像系統軟件Labwork 4.5軟件進行處理并分析[11]。

1.3.6 掃描電鏡分析

取適量不同水解度的SPI樣品均勻粘在掃描電鏡觀察臺上，用離子濺射鍍膜儀在蛋白表面噴金，約10 nm厚。處理好的樣品置于樣品盒中，加速電壓為20 kV，用掃描電子顯微鏡放大500倍下觀察SPI的微觀結構[12]。

1.3.7 統計分析

除非另有說明，所有實驗重復3次，并且結果表示為重復分析的平均值±標準偏差。利用SPSS系統對數據進行方差分析（ANOVA）分析和最小顯著差異（LSD）實驗。顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 SPI的水解曲線

對比水解SPI不同時間對其水解度的影響。選擇1 h～7 h進行水解，每隔1 h對水解度進行測定，SPI被中性蛋白酶水解曲線如圖1所示。

圖1 SPI水解不同時間對水解度的影響Fig.1 Influence in hydrolysis degree over time of SPI

由圖1可知，隨著酶解時間的延長，水解度程增長趨勢。在SPI水解初期，水解度明顯增長，之后其增長速度逐漸趨于緩慢。水解時間從1 h至7 h過程中，水解度顯著增加（P＜0.05）。其中當水解 5 h～7 h時，水解度增加不顯著（P＜0.05）。由水解曲線表明，水解前4小時，SPI的水解速度較快。在前4小時內，每隔1 h，測定得到的水解度均出現顯著增長的變化。在水解5 h～7 h過程中，水解的增長速度趨于平緩，此時的酶促反應趨于平穩階段，水解度無明顯增加。水解度隨SPI水解時間的變化趨勢與Chen等利用胰蛋白酶對蛋清蛋白酶解的研究結果相似[13]，結果表明：水解1 h時，其水解的增長速度較快，之后呈降低趨勢，直到5 h后水解度無明顯增加。

2.2 SPI的表面疏水性分析

蛋白質的疏水作用對其構象、穩定性和功能性具有重要意義。且蛋白質的表面疏水性對其分子間的相互作用也有較大影響，因此，表面疏水性是蛋白質的一個重要性質。本穩對研究了不同水解度下的SPI與表面疏水性的關系，結果如圖2所示。

SPI的DH與表面疏水性的關系如圖2所示，隨著水解度的增長，SPI的表面疏水性呈增長趨勢。當DH在6.5至18.5之間時，SPI的表面疏水性明顯增加（P＜0.05）。當SPI的DH為6.5%時，其表面疏水性為

圖2 SPI的水解度與表面疏水性的關系Fig.2 Relationship between hydrolysis degree and surface hydrophobicity

2.3 SPI的SDS-PAGE凝膠電泳分析

對不同水解度下的SPI進行SDS-PAGE進行凝膠電泳分析，以分子量13 kDa～210 kDa的標準蛋白做對照，結果如圖3所示。

圖3 不同水解度下的SPI的凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic pattern of different SPI in degree of hydrolysis

圖3為不同水解度下制備得到的SPI電泳圖，圖中顯示了蛋白質的分子量分布。正如圖3所示：SPI經中性蛋白酶酶解后形成的SP分子量分布情況來看，少部分多肽或亞基的分子量大于210 kDa，而大部分多肽或亞基集中分布在 210kDa～20kDa（圖 3，泳道 1～6）。

如圖3所示，隨著水解度的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽與亞基分布相似（圖3，泳道1～6）。通過不同水解度下制備的SPI電泳圖對比，發現水解度為13.7的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（圖3，泳道3中的條帶e）和水解度為18.5的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（圖3，泳道4中的條帶e）含量在其他不同水解度下制備的SPI的電泳圖中減小，且水解度分別為6.5、7.7、20.1、21.4的SPI的條帶在17.5 kDa以下無分布（圖 3-2，泳道 1、2、5、6，e條帶所示）。同時，在不同水解度下制備得到的SPI的電泳圖中，我們發現隨著水解度的增大，SPI的電泳圖中部分條帶顏色先變淺后加深（圖 3，泳道 1～6 的條帶 a，b，c，d，泳道 6，條帶 b所示）。根據其他研究者報道[19-20]，在蛋白質合成過程中，新條帶的形成或條帶的加深表明有新的聚集肽生成，這些聚集肽可能是由許多低分子量的肽聚集產生。因此隨著水解度的繼續增加，疏水集團暴露增加，亞基與亞基之間通過疏水相互作用形成聚集體，二者結合越多，所以在水解度為20.1和21.4環境下制備的SPI的該區域的條帶顏色加深，聚集肽含量增加。

2.4 SPI的掃描電鏡分析

為了觀察不同水解度下的SPI的微觀結構變化，因此，分別對其進行掃描電鏡測定，如圖4所示。

圖4 不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖片Fig.4 SEM images of different SPI in degree of hydrolysis

圖 4 中（a）、（b）、（c）、（d）各圖分別為不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖片，其觀察倍數為500倍。通過觀察發現，不同水解度下的SPI微觀結構分布，皆呈單個球狀蛋白分布，且分布較為松散，同時每個球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態（圖4）。由圖4可知，經酶解后的SPI球蛋白表面呈塌陷狀，且通過不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖對比可知：隨SPI的水解度增大，大豆分離蛋白的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

3 結論

通過對水解SPI不同時間的水解度測定，同時采用熒光探針法對不同水解度下制備的SPI的表面疏水性進行測定，結果發現：隨著酶解時間的延長，水解度程增長趨勢。在SPI水解初期，水解度明顯增長，之后其增長速度逐漸趨于緩慢；隨著水解度的增長，SPI的表面疏水性呈增長趨勢。通過不同水解度下制備的SPI的電泳分析，隨著水解度的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽與亞基分布相似，隨著水解度的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，且新增的聚集肽的含量增多。SPI微觀結構分布，皆呈單個球狀蛋白分布，且分布較為松散，同時每個球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態隨SPI的水解度增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

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Structural Characterization of Soybean Protein Isolation at Different Hydrolysis Degree

HUANG Wen-xiu，LI Cheng-hui，WANG Ji-long，TANG Ming-li，ZHAO Fei，CHEN Peng
（Shandong Yuwang Ecogical Food Industry Co.，Ltd.，Yucheng 251200，Shandong，China）

The hydrolysis of soybean protein isolated（SPI）at neutral protease，for forming soybean protein isolation at different hydrolysis degree（DH）.The surface hydrophobicity，secondary structure and microstructure of SPI have been investigated by using a combination of determination of fluorescence probe，SGS-PAGE and transmission electron microscopy（TEM）methods.The result showed that：with the increase of DH，The surfacehydrophobicity was on the rise.SPI was hydrolyzed to form gradually more low molecular weight peptides，the peptides and base were similar.With the increase of DH，the content of low molecular weight peptides was first increased and then decreased，and the content of the new accumulation peptide was increased.Distribution of SPI at different DH was single globular protein，and relatively loose，the base was distributed on each of the globular protein，sphere surface of most of the globular protein was on subsidence.With the increase of DH，the subsidence of sphere surface of globular protein was obvious，and the base was not dissociation.

soybean protein isolated；hydrolysis degree；surface hydrophobicity；structure characterization

2016-11-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.006

黃文秀（1989—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品科學。