酸奶中6種合成甜味劑的測定方法

王成華，宋蘇，王卉，范廣宇，孟祥龍，姚燕林

（連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇連云港222042）

酸奶中6種合成甜味劑的測定方法

王成華，宋蘇，王卉，范廣宇*，孟祥龍，姚燕林

（連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇連云港222042）

建立液相色譜-質譜/質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）同時測定酸奶中安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、糖精鈉的分析方法。樣品經甲酸-三乙胺緩沖溶液提取后，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀析出蛋白質，經HLB固相萃取小柱凈化后，再通過Phenomenex XB-C18色譜柱分離，以含0.1%（體積分數）的甲酸溶液和甲醇為流動相，進行梯度洗脫，可以在3 min內完成6種人工合成甜味劑的基線分離。在ESI負離子模式下，采用多反應監測模式進行測定，在加標水平為10、25、50 μg/kg時，被測物的回收率達到70.50%～102.10%，相對標準偏差為1.56%～4.83%。該方法可用于酸奶及其他乳酸菌飲品中合成甜味劑的測定。

酸奶；液相色譜-質譜/質譜法；安賽蜜；甜蜜素；阿斯巴甜；阿力甜；紐甜；糖精鈉

酸奶是以牛奶為原料，經過巴氏殺菌后再向牛奶中添加發酵劑，經發酵后，再冷卻灌裝的一種牛奶制品。酸奶不但保留了牛奶的所有優點，而且某些方面經加工過程還揚長避短。其主要功效為降血壓，瘦身，促消化，防止便秘，成為更加適合于人類的營養保健品。為了迎合人們的口味，生產商們往往添加一種或幾種甜味劑來達到酸甜的口感[3]。隨著消費和認識水平的提高，甜味劑的使用情況越來越受到人們的關注[1]。其中，安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、糖精鈉6種合成的甜味劑更是受到添加劑行業的青睞。

關于甜味劑檢測的標準，均是針對某個和某幾個甜味劑的檢測，主要采用氣相色譜法和高效液相色譜法[4-5]。目前在食品生產加工過程中，同時使用多種甜味劑，定量檢測這些甜味劑不僅是為了保證產品的質量，更重要的是保護消費者的利益。因此，建立一種能同時測定這些甜味劑的方法就顯得十分重要。對于食品中多組分甜味劑的分析，不可避免會遇到以下問題：（1）由于色譜的分辨能力有限，當樣品中組分過多時，色譜手段很難將所有的組分分離；（2）相鄰的色譜峰，當保留時間相近時，僅靠保留時間對組分定性既不準確也不充分；（3）對于復雜基質的樣品，基質的干擾僅靠紫外檢測器很難進行排除。本試驗采用LCMS/MS技術，利用串聯質譜分離能力強，MRM定性準確、選擇性和靈敏度高的特點，能在較短的時間內對多組分進行一次性的分離和鑒定，建立一種可同時測定并能夠準確定性食品中多種甜味劑的方法[6]。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6490液相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；THZ-92A型振蕩器：艾卡儀器設備有限公司；XW-80A型旋渦混合器：上海青浦滬西儀器制造廠；TDL-40C臺式離心機：上海安亭儀器廠；N-EVP 112氮氣吹干儀：上海秉越電子儀器有限公司；VISZPREP固相萃取裝置：美國Supelco公司。甲醇（HPLC純）：德國默克股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）、三乙胺：南京化學試劑有限公司；甲酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：國藥集團化學試劑有限公司；Waters oasis HLB萃取柱（6 mL）：天津市天興達科技有限公司；水為符合GB/T 6682-2008《分析實驗室用水國家標準》規定的一級水。

甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、糖精鈉：純度大于95.0%，德國Dr.Ehrenstorfe標準品有限公司。阿力甜和紐甜：純度大于95%，北京曼哈格生物科技有限公司。準確稱取該標準品，用空白樣品基質配制成適當濃度的混合標準工作液，使用前配制。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（50mm×2.1mm，2.6μm）；流動相：A為0.1%（體積分數，下同）甲酸，B為甲醇；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。流動相的洗脫程序見表1。

表1 流動相的洗脫程序Table 1 The mobile phase elution program

1.3 質譜條件

離子源：ESI；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測掃描模式（MRM）。干燥氣溫度：290℃；干燥氣流速：14 L/min；碰撞氣壓力：20 Pa；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細管電壓：-4 500 V。其他質譜參數見表2。

表2 6種合成甜味劑的質譜參數和保留時間Table 2 Mass spectrum parameters and retention time 6 kinds of synthetic sweeteners

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取2 g酸奶樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲酸-三乙胺緩沖溶液，渦旋混勻，超聲30 min后取出，加入5 mL的10%的亞鐵氰化鉀和20%的乙酸鋅溶液以及5 mL的三氯甲烷，渦旋混勻以3 500 r/min的速度離心5 min，取上層清夜轉移至另一只50 mL的離心管中，在殘渣中加入10 mL的提取液重復以上提取過程，待凈化。

1.4.2 樣品的萃取

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化HLB固相萃取柱，棄淋洗液，將上清液過柱子，棄流出液。然后用5 mL水淋洗，棄去淋洗液，抽干。用9 mL的甲醇洗脫，收集洗脫液至離心管中，在35℃下氮吹濃縮至0.5 mL，并用甲醇-水（3∶7，體積比）定容至 1 mL，過 0.22 μm 有機濾膜，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

研究表明6種甜味劑都是水溶性的[7]，本試驗比較了0.1%甲酸溶液、0.08%的甲酸溶液、水3種水相提取劑。結果表明0.08%甲酸溶液優于0.1%甲酸溶液和水，由于高pH值會影響阿斯巴甜的穩定性，故加入三乙胺來調節提取劑的pH值，當三乙胺為2.5 mL，pH=4.5時阿斯巴甜的回收比較理想。

2.2 流動相條件的優化

通過對SN/T 3538-2013《出口食品中六種合成甜味劑的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》的檢測標準進行比較[8]，先對流動相條件進行摸索，流動相水相嘗試了水、0.1%乙酸銨溶液和0.1%甲酸溶液，有機相嘗試了甲醇和乙腈。采用0.1%乙酸銨溶液作為水相，無論有機相是甲醇還是乙腈，甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜的質譜響應都很低，這可能是由于在負離子掃描模式下加入乙酸銨會抑制目標化合物的離子化效率，無論有機相是甲醇還是乙腈，相對于水，采用0.1%甲酸溶液可以獲得更好的質譜響應和峰型效果。流動相的選擇不僅要考慮對組分的洗脫能力，而且還需考慮在質譜中是否能促使目標化合物達到較高的離子化效率。因此又考察了乙腈-0.1%甲酸溶液體系和甲醇-0.1%甲酸溶液體系，相比之下，甲醇-0.1%甲酸溶液體系可以獲得更好的質譜響應。

2.3 質譜檢測及色譜分離條件的優化

先對6種人工合成甜味劑分別在全掃描模式下進行掃描，分別確定6種準分子離子。從6種人工合成甜味劑的分子結構看，電噴霧離子源中易失去一個氫原子而帶負電荷，且負離子模式下準分子離子峰強度高于正離子模式，即負離子模式下的靈敏度高于正離子模式，因此選擇電噴霧離子源負離子模式對其進行檢測。6種人工合成甜味劑的總離子流圖譜見圖1。

圖1 6種合成甜味劑標準溶液總離子圖（10 μg/kg）Fig.1 Total ion chromatogram of 6 kinds of synthetic sweeteners（10 μg/kg）

2.4 線性關系及標準曲線

以空白的酸奶樣品為基質制成基質空白標準溶液，再將6種人工合成甜味劑制成相應質量濃度的系列標準溶液，以6種人工合成甜味劑的峰面積作為縱坐標，目標物的線性方程、相關系數、線性范圍和檢出限見表3。

表3 目標物的線性方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table 3 The target of linear equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

2.5 精密度及回收率驗證

加標濃度分別為0.10、0.25、0.50 mg/kg的回收率試驗，每份樣品分別測定6次，結果見表4。

從結果可知，其平均回收率在70.50%～102.10%之間，相對標準偏差（RSD）為1.56%～4.83%。

表4 6種合成甜味劑的回收率及標準偏差Table 4 The recovery rate and standard deviation for 6 kinds of synthetic sweeteners

3 結論

本研究通過優化流動相條件、質譜和色譜條件，建立了同時測定6種合成甜味劑的液相色譜-串聯質譜法。該方法不僅實現了食品中多種合成甜味劑的同時測定，提高了檢測效率，同時結果準確，靈敏度高，耗時短，能夠有效的避免利用液相色譜法測定對復雜基質樣品出現的假陽結果。該方法能夠滿足SN/T 3538-2013《出口食品中六種合成甜味劑的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》對以上6種合成甜味劑的規定使用量檢測要求，為甜味劑檢測提供一種高效、快捷、準確的檢測方法。利用液相色譜-質譜聯用技術建立多組分的甜味劑同時測定的方法將成為將來食品安全檢測技術的發展方向之一。

[1] 劉曉霞,丁利,劉錦霞,等.高效液相色譜一串聯質譜法測定食品中6種人工合成甜味劑[J].色譜,2010,28(11):1020-1025

[2] 峰恩,楊國生,譚璐,等.色譜分析法檢測人工合成甜味劑研究進展[J].山東農業科學,2011(12):1205-1210

[3] 吳婕,楊柳.高效液相色譜法同時測定食品中防腐劑、甜味劑和色素[J].化學工程與裝備,2010(10):910-914

[4] 譚朝勤,吳新.高效液相色譜法同時測定面包糕點中苯甲酸(鈉)、山梨酸(鉀)、安賽蜜、糖精鈉和脫氫乙酸(鈉)的含量[J].廣東化工,2009(6):458-462

[5] 文君,繆紅,王鮮俊,等.氣相色譜法測定食品中甜蜜素[J].中國公共衛生,2003,9(19):2013-2017

[6] 柯潤輝,王麗娟,安紅梅,等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定白酒中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑[J].食品與發酵工業,2015(12):1300-1305

[7] 馬康,蔣孝雄,趙敏,等.高效液相色譜法同時測定軟飲料中20種食品添加劑[J].分析化學,2012(11):1121-1124

[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 3538-2013出口食品中六種合成甜味劑的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法[S].北京:中國質檢出版社,2013:1-25

The Inspection Method of Six Kinds of Synthetic Sweeteners in Yogurt

WANG Cheng-hua，SONG Su，WANG Hui，FAN Guang-yu*，MENG Xiang-long，YAO Yan-lin
（Lianyungang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang 222042，Jiangsu，China）

Set up a method of liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry （LC-MS/MS）to detect the acesulfame，cyclamate，aspartame，alitame，neotame，saccharin sodium in yogurt.The sample was extracted by formic acid-triethylamine buffer solution.Add some potassium ferrocyanide and zinc acetate then the protein will be precipitated，purified by HLB solid-phase，through Phenomenex XB-C18 chromatographic column for separation，with 0.1%（volume fraction）formic acid and methanol as mobile phase，then the separation of these 6 kinds of synthetic sweeteners within 3 minutes by gradient elution.In the negative ion mode，measured with the multiple reaction mode，when the external standard level with 10，25，50 μg/kg，the recovery rate can be 70.50%-102.10%，and the relative standard deviation can be 1.56%-4.83%.This method is fast，accurate and high sensitivity.It can be used in the determination of synthetic sweeteners in yogurt and other lactic acid bacteria beverage.

yogurt；liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry；acesulfame；cyclamate；aspartame；alitame；neotame；saccharin sodium

2016-12-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.033

王成華（1987—），女（漢），學士，主要從事進出口食品中獸藥殘留及食品添加劑的檢測工作。

*通信作者