真菌發酵虻蟲活性物質提取、分離及含量測定

王立娜，劉春雨，王 穎，王集會

(1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

真菌發酵虻蟲活性物質提取、分離及含量測定

王立娜1，劉春雨1，王 穎1，王集會2*

(1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

通過超聲水提法提取發酵虻蟲干粉中水溶性總蛋白，利用改良Lowry法測定其含量；并采用80%乙醇回流提取的方法提取總黃酮，并通過石油醚、乙酸乙酯分別萃取，同時通過NaNO2-AlCl3-NaOH比色法測定發酵虻蟲粉不同極性部位中總黃酮的含量。結果表明發酵后虻蟲粉中水溶性總蛋白的平均含量高達99.3140mg/g，而在醇提物中水部總黃酮含量明顯高于石油醚部和乙酸乙酯部。

發酵；虻蟲干粉；超聲水提；醇提；含量對比

虻蟲又稱牛蜢，牛虻，屬虻科昆蟲復帶虻(Tabanrrs bivittatus Mats)昆蟲的雌性干燥全體。中藥虻蟲是一味傳統的活血散瘀類中藥。《神農本草經》[1]記載：“蜚虻味苦微寒，主逐瘀血，破下血積，堅痞，癥瘕，寒熱，通利血脈及九竅”。現在主要作為中藥成方制劑如大黃庶蟲丸之原料，治療冠心病，心絞痛[2]等病癥。隨著虻蟲藥用價值的不斷開發和研究，有研究發現虻蟲在抗凝血[3]及抗肝癌[4]方面有較好療效。利用球孢白僵菌(Beauveria bassiana (Bals.) Vuill)作為發酵菌，虻蟲作為發酵基質，利用基質中所含有的豐富的氮源、碳源、微量元素、礦物質等真菌生長所需的物質，在一定的溫度、濕度、時間等條件下，經過白僵菌、虻蟲中所含有的物質的相互作用和一系列的生物轉化過程，虻蟲的大蛋白會被真菌產生的蛋白酶酶解成小分子的具有更強抗腫瘤、抗病毒活性的成分，同時，白僵菌在生長的過程中也會產生大量的次生代謝物質，其中最具代表性的是黃酮類、聚酮類物質，經研究表明其具有明顯的抗腫瘤和抗病毒[5]的療效。將發酵后虻蟲粉的水提液進行蛋白質含量的測定，而醇提液則依次通過石油醚、乙酸乙酯進行萃取，不同的極性部位分別進行總黃酮測定，找出豐度最高的部位為下一步發酵虻蟲的藥理及臨床應用打下基礎。目前國內外對發酵虻蟲蛋白質和黃酮類化合物的研究未見資料報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蘆丁標準品(CHENGDU MUST BIO-TECHNOLOGY CO,LTD.)、牛血清蛋白(BSA，國藥集團化學試劑有限公司)、福林酚(國藥集團化學試劑有限公司)、酒石酸鉀、無水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉、六水氯化鋁、亞硝酸鈉乙醇、皆為分析純。

1.1.2 儀器

TDZ5-WS臺式多管低速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；UV9100B型可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發酵虻蟲粉的制備

精密稱取一定量的虻蟲干粉，滅菌，同時加入適量的活的球孢白僵菌孢子粉，然后在孢子粉中加入較少量表面活性劑吐溫-80，并按一定比例用滅菌水將其稀釋成含有1×108個孢子的混懸液，拌勻潤濕，控制溫度25～28℃以及濕度為95%的培養條件下，在恒溫恒濕培養箱中發酵7天左右，等長滿發酵白色菌絲后即停止發酵，滅活，冷凍干燥即得發酵物。

1.2.2 發酵虻蟲粉中水溶性總蛋白和總黃酮的提取

1.2.2.1 水溶性總蛋白的超聲提取

精密稱取發酵虻蟲粉1.0000 g至100 mL燒杯中，向燒杯中加入15 mL蒸餾水使其溶解，并超聲提取10 min，濾過，取其上清液，重復上述步驟兩次,去掉殘渣。將三次上清液混合轉移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻，靜置。

1.2.2.2 不同部位的總黃酮提取液的制備

精確稱取發酵虻蟲粉10.0000 g，按料液比1：25加入定量80 %乙醇，超聲提取20 min后，將溶液倒入500 mL圓底燒瓶中，在80 ℃水溫條件下，回流1.5 h，將黃酮粗提液抽濾，棄去殘渣，收集濾液，旋蒸揮去乙醇，濃縮成浸膏，加入浸膏量10倍的蒸餾水混懸，然后加入浸膏料液比1:10的石油醚，萃取3次，靜置分層，收集石油醚部并量取其體積及收集水部，將水部加入相同量的乙酸乙酯，萃取3次，靜置分層，收集乙酸乙酯部量取體積，收集水部，量取其體積。

1.2.3 Lowry法測定發酵虻蟲粉中水溶性總蛋白含量[6]

1.2.3.1 堿性銅溶液的制備

分別量取0.1mol/L酒石酸鉀溶液與0.04mol/L硫酸銅溶液 0.5 mL，4 %碳酸鈉溶液與溶液各25mL，搖勻，即得，使用時要現用現配。

1.2.3.2 標準牛血清蛋白溶液的制備

精密稱取0.0200 g牛血清蛋白于燒杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，靜置，即得200 μg/mL的標準牛血清蛋白溶液。

1.2.3.3 標準曲線的制備

分別用移液槍精密量取標準牛血清蛋白質溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于試管中，并編號，然后補加蒸餾水至1 mL，立即加入堿性銅溶液5 mL，搖勻，室溫放置10 min后，快速加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻后室溫放置30 min，顯色后，以水作空白對照，并于650 nm波長處測定各樣品吸光度。以標準蛋白質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到直線回歸方程，見圖1。

1.2.3.4 發酵虻蟲粉中水溶性總蛋白含量的測定

用移液槍吸取2 mL發酵虻蟲粉水提液于10 mL容量瓶中，定容，搖勻后吸取1 mL置試管中，按照1.2.3.3項下方法，自"加堿性銅溶液5 mL"起，測定其吸光度，通過標準曲線計算出供試品溶液中所含蛋白質的質量(mg)。分別測量三次，取平均值，見表1。

1.2.4 NaNO2-AlCl3-NaOH比色法測定發酵虻蟲粉中總黃酮的含量[7]

1.2.4.1 蘆丁標準品溶液的配制

精密稱取蘆丁對照品20 mg，用60 %乙醇溶解后，轉移到100 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻，即為濃度為200 μg/mL的標準溶液，放置在4 ℃冰箱保存備用。

1.2.4.2 標準曲線的繪制

分別用移液槍吸取標準液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL試管中，補加30 %乙醇至5 mL，迅速加入5 %的亞硝酸鈉溶液300 μL，搖勻后靜置6 min；然后加600 μL 10 %的六水氯化鋁溶液，5 min后，加入2 mL 1.0 M的氫氧化鈉溶液，再用30 %乙醇補加至刻度。然后在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁吸光度(Y)對質量濃度(X)進行回歸分析，制作標準曲線，得到直線回歸方程，見圖2。

1.2.4.3 發酵后虻蟲粉中總黃酮含量的測定

精密吸取不同部位發酵虻蟲粉黃酮提取液2 mL于試管中,按照1.2.4.2項下方法，自"加30 %乙醇至5 mL"起，依次測定吸光度，通過回歸方程求得待測樣品溶液中總黃酮的質量(M)。分別測量三次，取平均值，見表2。

2 結果與分析

1.1 蛋白質標準曲線結果如圖1。

圖1 蛋白質標準曲線

1.2 發酵虻蟲水溶性蛋白質含量如表1。

表1 水溶性蛋白質含量 mg/g

1.3 黃酮標準曲線如圖2。

圖2 黃酮標準曲線

1.4 不同極性部位黃酮含量

不同極性部位黃酮含量見表2。

表2 不同極性部位黃酮含量 mg/g

水部黃酮含量最高，乙酸乙酯部次之，石油醚部最少，說明不同極性部位總黃酮含量存在差異，其在極性大的水和乙酸乙酯中溶解度較大，而在低極性石油醚中基本不溶解。

3 討論生物轉化技術是藥性真菌發酵炮制中藥的最新應用，本實驗以中藥虻蟲粉為培養基，添加適量的球孢白僵菌，進行發酵炮制。利用酶強大的分解轉化能力，對虻蟲粉中的蛋白質、黃酮加以利用，從而在代謝過程中轉化修飾，提高虻蟲粉中活性成分的藥效作用，而且通過本實驗可以得知發酵后的虻蟲粉中含有大量的蛋白質，但是與發酵前相比蛋白質含量是否有所增加，以及對其活性成分——黃酮在每個部位的抗腫瘤活性將是我們下一步的研究工作。

[1] 姜 波,趙榮國,高示賢,等.虻蟲的本草考[J].證現代應用藥學,1992,9(3):112.

[2] 李軍德. 中藥虻蟲研究進展[C]// 中國中西醫結合學會中藥專業委員會.2009年全國中藥學術研討會論文集.[出版地不祥]：[出版者不祥], 2009:5.

[3] 梁進權,宓穗卿,王寧生.水蛭、虻蟲配伍的抗凝血和抗血小板聚集的作用[J].中藥材,200932(9):1347-1350.

[4] 周志愉,余 功,饒 斌,等.破血逐瘀中藥虻蟲對荷H22肝癌小鼠內皮生長因子及MMP-9蛋白表達的影響[J].廣州中醫藥大學學報,2016,33(2):224-228.

[5] 蔣 學.白僵蠶活性成分分離純化及其藥理作用的研究[D].杭州：浙江大學,2013.

[6] 王立娜, 馬明珠, 王 穎, 等. 中藥土鱉蟲發酵前后活性成分的含量對比[J].湖南中醫雜志, 2016, 32(8): 200-202.

[7] 王立娜,馬明珠,王集會. 發酵土鱉蟲總黃酮含量的測定及方法學考察[J].安徽農業科學,2016,44(21):95-97.

(本文文獻格式：王立娜，劉春雨，王 穎.真菌發酵虻蟲活性物質提取、分離及含量測定[J].山東化工，2017，46(06)：82-83，88.)

The Active Ingredients of Extraction, Separation and Determination for the Fermented Tabanid by Fungus

WangLina1,LiuChunyu1,WangYing1,WangJihui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Experiment Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

To extract the total soluble protein by ultrasonic for the fermented tabanid of fungus . And using the improved Lowry method to determine the content of tabanid . and using the method of 80% ethanol to extract total flavonoids . Then to determine the extractive of petroleum ether, ethyl acetate of total flavonoids of the fermented tabanid different polar parts table by using NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetric method. The results showed that the average content of total water-soluble protein after fermentation as high as 99.3140 mg/g , while the total flavonoids content in the ethanol extract was significantly higher than that in the petroleum ether and ethyl acetat.

fermentation; tabanid; ultrasonic extraction; ethanol extraction; content comparison

2017-02-15

山東中醫藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(項目編號：2016052)

王立娜(1996—)，女，本科在讀，研究方向制藥工程；通訊作者：王集會(1962—)，副教授，研究方向：蟲類中藥發酵及活性成分研究。

R284

A

1008-021X(2017)06-0082-02