馬齒莧多糖體外免疫調節活性研究

陶貴斌，何慧楠，李雪惠，劉雪瑩，齊濱，劉莉

（長春中醫藥大學藥學院，吉林長春130117）

馬齒莧多糖體外免疫調節活性研究

陶貴斌，何慧楠，李雪惠，劉雪瑩，齊濱*，劉莉*

（長春中醫藥大學藥學院，吉林長春130117）

以小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型研究馬齒莧多糖對細胞吞噬能力的影響，刺激產生NO含量，釋放IL-6、TNF-α來考察其對巨噬細胞免疫活性的影響。結果表明馬齒莧多糖可通過增強巨噬細胞吞噬能力，釋放免疫因子等方面增強巨噬細胞免疫活性。

馬齒莧多糖；巨噬細胞；免疫調節

馬齒莧（Portulace oleracea L.）為馬齒覓科一年生肉質草本植物，是一種藥食兩用植物，主要以野生為主，西歐發達國家己經將其發展栽培成為蔬菜以供食用。馬齒莧在我國資源儲備極其豐富，其所包含的化學成分多種多樣，主要有氨基酸、多糖類、有機酸、黃酮類、香豆素、生物堿、強心苷、蒽醌、維生素和礦物質等化合物[1-5]。馬齒莧具有廣泛的藥理作用，在抗衰老、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化，以及保肝護肝等方面具有重要的作用[6-9]。馬齒莧多糖是近年來新發現的一種新的活性成分，具有提高免疫力，延緩衰老，抗腫瘤等活性[10-11]，國內外學者對馬齒莧多糖的藥理活性的研究多集中于動物實驗，從細胞水平去探索馬齒莧多糖的生物活性報道較少，本研究以馬齒莧多糖提取物為研究對象，探討馬齒莧多糖對小鼠巨噬細胞的調節作用，從細胞水平研究其體外免疫調節的作用，為馬齒莧多糖的活性研究提供新的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

馬齒莧：采于吉林省長春市市郊。

小鼠巨噬細胞樣細胞株RAW264.7（ATCCTIB-71）：中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

DMEM 培養基：Gibco公司；噻唑藍（MTT）：Thiazoly公司；二甲基亞砜（DMSO）：天津天泰精細化學品有限公司；TNF-α酶聯免疫測定試劑盒、IL-6酶聯免疫測定試劑盒：上海朗頓生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：Sigma 公司；Griess：上海碧云天生物技術有限公司。

Infinite 200 Pro型酶聯免疫檢測儀：瑞士TECAN公司；3111型CO2培養箱：Thermo Forma公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧多糖的制備

準確稱量干燥的馬齒莧100 g，粉碎，將粉末置于圓底燒瓶中加入95%乙醇，攪拌、80℃水浴，冷凝回流6 h，除去乙醇，干燥。干燥后粉末水煎煮3次，離心取上清液，4℃靜置過夜，取上清溶液真空濃縮，濃縮液加無水乙醇沉淀過夜，Sevage法除蛋白，干燥，制得馬齒莧多糖（POP）樣品。采用苯酚硫酸法測得多糖含量為23.35%，精密稱取多糖干粉20 mg，加10 mL無菌PBS緩沖液溶解，用0.22 μm濾膜無菌過濾分裝，-20℃保存，備用。待做細胞實驗時，取出用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液稀釋成 200、100、50 μg/mL。

1.2.2 細胞吞噬能力實驗

取對數生長期的RAW264.7細胞制成細胞懸液，細胞密度為6×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃，5%CO2的培養箱中培養6 h。待細胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，補加80 μL培養基，每個濃度設6個復孔，空白組以同體積無菌PBS代替，陽性對照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養24 h。用中性紅吞噬實驗檢測細胞吞噬能力，每孔加入100 μL 0.075%的中性紅溶液，繼續孵育1h后，吸出孔內培養基，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）吸去殘留中性紅，加入150 μL90%乙酸乙醇裂解液，充分混勻，測定每孔在550 nm處的光度值（OD）。

1.2.3 NO含量檢測

取對數生長期的RAW264.7細胞制成細胞懸液，細胞密度為2×106個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃，5%CO2的培養箱中培養6 h。待細胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，補加80 μL培養基，每個濃度設6個復孔，空白組以同體積無菌PBS代替，陽性對照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養24 h。采用Griess法測定NO含量：標準孔加入濃度為100 μmol/L 的亞硝酸 0、10、20、30、40、50 μL，加蒸餾水補足50 μL，樣品孔分別加入各組培養基50 μL，之后再加入50 μL Griess試劑，振搖10 min，測定各孔于540 nm處的光度值（OD），根據標準孔繪制出亞硝酸濃度與光度值的標準曲線，并計算各樣品孔NO濃度。

1.2.4 IL-6、TNF-α 含量檢測

細胞培養液中IL-6的測定參照小鼠白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，將各組細胞上清液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，吸取上清20 μL進行酶聯免疫吸附反應，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算IL-6含量。

細胞培養液中TNF-α的測定參照小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，將各組細胞上清液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，吸取上清20 μL進行酶聯免疫吸附反應，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算TNF-α含量。

1.2.5 數據處理

所有數據均以均值±標準差表示。t檢驗采用SPSS11.5統計軟件包完成，以P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結果與討論

2.1 馬齒莧多糖對細胞吞噬能力的影響

細胞具備吞噬能力的高低被當做衡量細胞活性的一個關鍵指標。本研究采取中性紅法來評價馬齒莧多糖對RAW264.7小鼠巨噬細胞吞噬作用的影響，結果見圖1。

圖1 馬齒莧多糖對RAW264.7細胞吞噬能力的影響（，n=9）Fig.1 Effect of purslane polysaccharides on the phagocytic ability of RAW264.7（，n=9）

如圖1所示，從馬齒莧多糖對RAW264.7細胞吞噬能力的影響可以看出，細胞吞噬能力與樣品濃度呈量效關系。結果表明馬齒莧多糖具有增強細胞吞噬能力的作用（P＜0.01）。

2.2 馬齒莧多糖對RAW264.7細胞釋放NO的影響

NO是氧化應激反應中的主要介質，氧化應激能參與并加劇炎癥反應，因此，NO的水平與多種炎癥疾病的發病機制密切相關。本研究采用Griess法檢測細胞培養上清液的亞硝酸鹽含量，從而間接反應RAW264.7細胞的NO分泌水平。Griess法測定NO含量所得標準曲線為y=0.003 3x+0.040 9，R2=0.999 7，由標準曲線得各組NO濃度如圖2所示。

圖2 馬齒莧多糖對RAW264.7細胞釋放NO的影響（，n=9）Fig.2 Effect of purslane polysaccharides on NO production of RAW264.7（，n=9）

由圖2可知空白組細胞產生NO最少，為（6.64±0.61）μmol/L，陽性對照組細胞產生NO最多，為（26.68±0.88）μmol/L，實驗組細胞產生NO含量隨馬齒莧多糖濃度的增加而增加。馬齒莧多糖不同濃度與空白組相比均有顯著性（P＜0.01），且各實驗組NO濃度均低于陽性對照組。

2.3 馬齒莧多糖對RAW264.7細胞分泌IL-6、TNF-α的影響

LPS可誘導巨噬細胞產生一系列炎癥反應。被激活的RAW264.7巨噬細胞可以釋放出多種具有免疫調節作用的細胞因子。IL-6作為一種多功能細胞因子，在免疫應答和炎癥反應中具有重要作用。馬齒莧多糖對RAW264.7細胞分泌IL-6的影響如圖3所示。

圖3 馬齒莧多糖對RAW264.7細胞分泌IL-6和TNF-α的影響（±s，n=9）Fig.3 Effect of purslane polysaccharides on IL-6 and TNF-α production of RAW264.7（，n=9）

從圖3可以看出，各組IL-6濃度均高于空白組。馬齒莧多糖對RAW264.7細胞分泌IL-6有促進作用，和空白組對比具有顯著性意義（P＜0.01）。

TNF-α可以殺死腫瘤細胞或起到抑制其生長的功效，可以提高中性粒細胞的吞噬、增殖和分化能力。馬齒莧多糖各濃度均能促進分泌TNF-α（P＜0.01），濃度為 200 μg/mL 時，TNF-α 含量最高為（3.53±0.11）ng/mL，是空白組的9.8倍。各組TNF-α濃度均小于陽性對照組，說明馬齒莧多糖促進RAW264.7細胞分泌TNF-α的作用溫和。

3 結論

巨噬細胞是機體非特異性免疫的關鍵細胞，病原微生物入侵機體時首先被巨噬細胞識別、吞噬，巨噬細胞的吞噬能力影響免疫應答強弱。本研究中用不同濃度的馬齒莧多糖培養RAW 264.7細胞，研究細胞吞噬能力、NO分泌能力、IL-6和TNF-α釋放能力。吞噬中性紅實驗結果表明馬齒莧多糖能夠激活RAW264.7細胞并具有增強其吞噬作用的能力。NO在細胞的生理調節中扮演著信使及效應分子的角色，實驗結果表明，馬齒莧多糖可以提高RAW264.7細胞的NO分泌水平，且與LPS模型對照組比較中同時具有差異顯著性，證明其對NO釋放水平的提高是在一定安全范圍之內，并沒有達到導致產生炎癥的效果。

巨噬細胞除對病原微生物的吞噬消滅作用外，還有免疫遞呈的作用。巨噬細胞免疫遞呈作用是通過釋放IL-6、TNF-α等免疫因子來實現的，這些免疫因子刺激T/B細胞，實現免疫級聯反應。TNF-α是一個經典的炎癥指標，具有誘導多種炎癥因子產生，最終導致細胞凋亡的作用，處于炎癥級聯反應的中心環節，其表達量的多少可以直接反映炎癥的嚴重程度。IL-6作為一種多功能細胞因子，具有抗炎和致炎的雙向功能，其作用與組織中的含量有關。本實驗研究結果表明：馬齒莧多糖對RAW264.7細胞釋放這兩種細胞因子具有較顯著的增強作用。

由上述結果可知，馬齒莧多糖可通過增強巨噬細胞吞噬能力、殺死病原微生物的能力和釋放免疫因子三方面增強巨噬細胞免疫活性，實驗結果表明馬齒莧多糖具有較好的活化巨噬細胞的活性，可以作為增強免疫的保健品和食品的原材料。

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The Study of Immunoregulatory Activity in vitro of Purslane Polysaccharides

TAO Gui-bin，HE Hui-nan，LI Xue-hui，LIU Xue-ying，QI Bin*，LIU Li*
（College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

The effects of purslane polysaccharides on phagocytosis of macrophages RAW264.7 were determined to stimulate the production of NO content，to release of IL-6，TNF-α to investigate the immune activity of macrophages.The results show that purslane polysaccharides can enhance macrophage phagocytosis，release of immune factors to enhance the macrophage immune activity.

purslane polysaccharides；macrophage；immunoregulation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.039

2016-12-14

國家自然科學基金（81274038）；吉林省教育廳“十三五”科學技術研究規劃項目（JJKH20170725KJ）

陶貴斌（1980—），男（漢），碩士，從事中藥分析研究。

*通信作者：劉莉（1978—）女，博士，碩士研究生導師，從事中藥活性研究；齊濱（1978—）男，博士，碩士研究生導師，從事中藥活性研究。