超聲波-復合酶耦合法制備花生粕抗氧化肽研究

馬利華，宋慧，陳學紅，陳鐸

（徐州工程學院食品學院，江蘇徐州221008）

超聲波-復合酶耦合法制備花生粕抗氧化肽研究

馬利華，宋慧，陳學紅，陳鐸

（徐州工程學院食品學院，江蘇徐州221008）

以花生粕為原材料，花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率為指標，研究不同酶解時間、超聲處理時間、超聲波功率、酶解溫度等處理條件對花生粕抗氧化肽提取效果的影響。研究花生粕抗氧化肽對3種自由基的清除效果。試驗結果表明：最佳提取條件為：底物濃度8%，超聲波功率為150 W、超聲處理時間5 min、酶解溫度為45℃、酶解時間為1.5 h，此條件下花生粕抗氧化肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率達到89.22%。超聲波-復合酶耦合法制備的花生粕抗氧化肽對3種自由基均有較強的清除能力，且清除醇溶性自由基能力最強。

花生粕；肽；超聲波-復合酶；提取；抗氧化

花生粕是從花生仁經壓榨提煉油料后的產品，富含植物蛋白和人體必需的八種氨基酸，脂肪含量少，蛋白質變性程度小，水分含量低，可消化性高，有豐富的營養價值，可以作為一種優質蛋白質來源[1-2]。

酶法生產的生物活性肽是用人體所需要的食品級植物蛋白酶，將人體平常所食的食物蛋白質酶解成小分子活性多肽。它具有極強的生物活性和多樣性[3-4]。

超聲波特有的空化作用以及機械振動、化學效應、擴散和乳化作用等可以加速細胞內有效成分的擴散釋放，從而提高提取率[5-6]。

食品保藏時每增加一個柵欄因子，就可以有保藏加和作用，使保藏效果更好，應用多種因子的條件都比單一因子要溫和，這種保藏技術稱為柵欄技術[7]。本試驗采用超聲波-復合酶耦合處理花生粕，制備花生粕抗氧化肽，并研究了其清除多種自由基的能力，為花生粕的綜合利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FeSO4、TCA、無水乙醇、TBA、CuSO4、牛血清蛋白（分析純）等：上海國藥集團；木瓜蛋白酶1.0×105U/g、中性蛋白酶 1.5×105U/g、堿性蛋白酶 1.0×105U/g、酸性蛋白酶 1.5×105U/g、胰蛋白酶 1.5×105U/g：無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：SIGMA公司。

PHS-3CA精密酸度計、7230G可見分光光度計型：上海精密科學儀器有限公司；KS-900C型超聲波細胞粉碎機：上海比朗儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發器：上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波提取花生粕抗氧化肽

在超聲時間為2 s，間隔時間為2 s，超聲功率為300 W，處理總時間為10 min的條件下，提取花生粕中抗氧化肽。

1.2.2 酶種類的確定

稱取花生粕置于三角瓶中，分別取酸性蛋白酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，酶底比為 2∶1（mg/g）加入 100 mL 水，在溫度為 45 ℃，自然pH值下酶解3 h，離心，取上清液在100℃的沸水中滅酶3 min，測花生粕抗氧化肽的含量。

1.2.3 復合酶比例的確定

在酸性蛋白酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶中，選出酶解效果最好的3種，兩兩復配，比例分別設為 1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1（質量比），酶底比為 2∶1（mg/g），加入 200 mL 水，在溫度為 45 ℃，酶解時間為3 h，自然pH值下酶解3 h，離心，取上清液在100℃的沸水中滅酶3 min，測花生粕抗氧化肽的含量。

1.2.4 超聲波-復合酶耦合提取花生粕抗氧化肽單因素試驗

1.2.4.1 超聲波功率的影響

稱取花生粕置于三角瓶中，酶底比為2∶1（mg/g）的組合酶，底物濃度8%，pH7.7，超聲時間2 s，間隔時間2 s，超聲處理總時間為5 min，分別在超聲波功率為50、100、150、200、250、300 W，45 ℃下酶解 1.5 h，離心，上清液滅酶，測花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.2 超聲時間的影響

稱取花生粕置于三角瓶中，酶底比為2∶1（mg/g）的組合酶，底物濃度8%，pH7.7，超聲波功率150 W條件下，超聲時間2 s，間隔時間2 s，分別在超聲處理總時間為 1、3、5、7、9、11 min，45 ℃下酶解 1.5 h，離心，上清液滅酶，測花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.3 酶解溫度的影響

稱取花生粕置于三角瓶中，酶底比為2∶1（mg/g）的組合酶，底物濃度8%，pH7.7，在超聲時間為2 s，間隔時間為2 s，超聲功率為150 W，處理總時間為5 min，分別在 35、40、45、50、55 ℃下酶解 1.5 h，離心，上清液滅酶，測花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.4 酶解時間的影響

稱取花生粕置于三角瓶中，酶底比為2∶1（mg/g）組合酶，底物濃度8%，pH7.7，在超聲時間為2 s，間隔時間為2 s，超聲功率為150 W，處理總時間為5 min，45℃下分別酶解 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 下酶解，離心，上清液滅酶，測花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.5 超聲波-復合酶耦合提取花生粕抗氧化肽正交試驗

根據單因素試驗，以酶解時間（h）、超聲時間（s）、超聲波功率（W）、酶解溫度（℃）為因素，進行四因素三水平的正交試驗。因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 花生粕抗氧化肽含量測定

采用雙縮脲[8]法。

1.2.7 測定DPPH自由基的清除能力

用分光光度法[8]測定。清除率SA可表示為：

式中：A0為DPPH與溶劑混合液的吸光度；Ai為DPPH與樣品反應后的吸光度，Aj為樣品與溶劑混合液的吸光度。

1.2.8 測定羥基自由基的能力清除

采用硫酸亞鐵法[9]，清除率P可表示為：

式中：A0為空白吸光度；Ai為樣品吸光度。

1.2.9 測定脂質過氧化物清除能力

采用硫代巴比妥酸法[10]，清除率I可表示為：

2 結果分析

2.1 不同種類酶對花生粕抗氧化肽提取的影響

不同種類酶對花生粕抗氧化肽提取效果的影響見圖1。

圖1 不同種類酶對花生粕抗氧化肽提取效果的影響Fig.1 Influence of different enzymes to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

如圖1所示，水解效果最好的酶依次為中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，所以選擇堿性蛋白酶，中性蛋白酶兩兩復配。

2.2 復合酶比例對花生粕抗氧化肽提取的影響

復合酶不同比例對花生粕抗氧化肽提取效果的影響見圖2。試驗結果表明，在堿性蛋白酶和中性蛋白酶的比例為3∶1（質量比）時，酶解效果最好，花生粕抗氧化肽含量達到6.547mg/mL。

圖2 復合酶不同比例對花生粕抗氧化肽提取效果的影響Fig.2 Influence of diffent complex enzyme scale to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

2.3 底物濃度對花生粕抗氧化肽提取效果的影響

當底物濃度不足時，反應體系中會剩余一部分酶沒有結合底物，沒有發揮催化作用，當所有酶都結合底物后，底物濃度再加大，酶的反應體系中沒有多余的酶進行催化作用，反應速度達到了飽和狀態，酶解產生的花生粕抗氧化肽也不會再增加[12]。底物濃度對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖3。由圖3可以看出，底物濃度從1%到8%，花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率均呈上升趨勢。

圖3 底物濃度對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.3 Influence of different substrate concentration to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

2.4 酶底比對花生粕抗氧化肽提取效果的影響

酶底比對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖4。

圖4 酶底比對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.4 Influence of different enzyme and substrate to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

由圖4可以看出，隨著酶底比的增加，花生粕抗氧化肽的多肽含量及DPPH自由基清除率均在一定范圍內呈上升趨勢，但到達一定濃度后，酶分子在體系中趨于飽和，部分酶分子不能和底物接觸，酶解效果趨于穩定[13]，酶底比對花生粕抗氧化肽提取效果的影響就不再增大。

2.5 超聲波功率對花生粕抗氧化肽提取效果的影響

超聲波功率對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖5。

試驗結果表明：超聲功率太小時，對細胞壁的破碎程度不足，造成多糖不能快速有效地溶出，隨著功率的提高，這種增溶作用也隨之明顯，但超聲功率過大也會造成原料在超聲場中停留時間過短，破壁作用減弱，而且可能造成反應器內局部溫度瞬時升高，從而破壞花生粕抗氧化肽的結構，降低花生粕抗氧化肽的提取率及DPPH自由基清除率[14]，綜合考慮選擇超聲波功率150 W。

圖5 超聲波功率對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.5 Influence of different ultrasonic power to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

2.6 超聲時間對花生粕抗氧化肽提取效果的影響

超聲時間對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖6。

圖6 超聲時間對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.6 Influence of different ultrasonic time to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

超聲波處理時間越長，超聲波對物料的作用越充分，水溶性成分浸出率越高，當達到一定時間后，溶液體系滲透壓達到平衡，浸出率趨于平穩。考慮生產周期等方面，超聲時間選擇5 min。

2.7 溫度對花生粕抗氧化肽提取的影響

化學反應中，升高反應體系的溫度，可以增加反應物的能量，從而加大反應物分子間有效的接觸頻率，因而加快了反應的速度。而每種酶都有其最佳的作用溫度，當作用溫度超過其最適溫度后，酶分子的空間結構會改變，酶蛋白質發生變性，造成酶活力減弱至完全喪失活力，酶促反應的速度也會迅速下降[15]。溫度對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖7。

圖7 溫度對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.7 Influence of the temperature to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

從圖7可以看到，溫度從30℃到45℃，提取液中花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率均上升，此后，隨著溫度的上升，花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率均下降。

2.8 酶解時間對花生粕抗氧化肽提取的影響

酶解反應時間對酶解進行程度有重要的影響，因為蛋白酶的水解反應是逐步進行的，如果反應時間太短，則酶解不充分，而當酶濃度達一定值時，所有酶都能結合底物而參與反應，此時再延長酶促反應時間，并不能顯著增加花生粕抗氧化肽的提取量[15]。酶解時間對花生粕抗氧化肽提取的影響見圖8。

從圖8可以看到，酶解反應從0.5 h到1.5 h，提取液中花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率是上升的，在1.5 h達到最大值。

圖8 酶解時間對花生粕抗氧化肽提取的影響Fig.8 Influence of the time to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

2.9 超聲波-復合酶耦合提取花生粕抗氧化肽正交試驗

根據以上單因素試驗結果，以酶解溫度、酶解時間、底物濃度、酶底比進行四因素三水平正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，超聲波-復合酶耦合提取花生粕抗氧化肽最佳組合為A2B2C2D2、A2B2C2D3，通過驗證試驗得出A2B2C2D2即酶解溫度為45℃，酶解時間為1.5 h，超聲波功率為150 W、超聲處理時間120 s為最佳提取條件，此時花生粕抗氧化肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率達到89.22%。

2.10 抗氧化性研究

2.10.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定見圖9。

試驗結果表明，在一定范圍內，3種方法提取制備的花生粕抗氧化肽含量對DPPH自由基的清除效果均呈線性關系，其相關系數R2分別達到0.9175、0.9518、0.902 1，花生粕抗氧化肽對DPPH自由基的半數清除率分別為 2.41、3.75、2.85 mg/mL。

圖9 不同提取方法提取液的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH·clearance rate of different methods

2.10.2 脂質過氧化物清除率測定

脂質過氧化物清除率測定見圖10。

圖10 不同提取方法提取液的脂質過氧化物清除率Fig.10 Lipid peroxidation clearance rate of different methods

試驗結果表明，在一定范圍內，3種提取方法制備的花生粕抗氧化肽對脂質過氧化物的清除效果均呈線性關系的，其相關系數R2分別為0.904 4、0.946 5、0.869 9。花生粕抗氧化肽對脂質過氧化物的半數清除率分別為 2.91、3.3、4.04 mg/mL。

2.10.3 羥基自由基清除率測定

羥基自由基清除率測定見圖11。

圖11 不同提取方法提取液的羥基自由基清除率Fig.11 Hydroxyl radicals clearance rate of different methods

試驗結果表明，在一定范圍內，3種提取方法制備的花生粕抗氧化肽對羥基自由基的清除效果均呈線性關系，其相關系數R2分別為0.944 2、0.966 5、0.932 6。花生粕抗氧化肽對羥基自由基的半數清除率分別為 2.975、3.67、3.76 mg/mL。

2.10.4 不同提取方法對花生粕抗氧化肽提取效果的比較

不同提取方法對花生粕抗氧化肽提取效果的比較見圖12。

圖12 不同提取方法對花生粕抗氧化肽提取效果的比較Fig.12 Compared of different methods to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

超聲波-酶耦合提取法結合了超聲波和復合酶的優點，屬于柵欄技術處理，處理程度低于單一的超聲波處理和復合酶處理，提取效果則最佳。比單一超聲波處理和復合酶處理提取液中花生粕抗氧化肽含量高21.65%、43.34%。

本試驗采用超聲波提取法、復合酶提取法及超聲波-復合酶耦合提取法制備花生粕抗氧化肽，分別測定其清除醇溶性自由基（DPPH自由基）、水溶性自由基（羥基自由基）和脂溶性自由基（脂質過氧化物）這3種自由基的能力，試驗結果表明，通過比較3種自由基的半數清除率可知，3種不同的方法制備的花生粕抗氧化肽均具有一定的抗氧化能力，超聲波-酶耦合法制備的花生粕抗氧化肽對3種自由基清除能力均最好，且清除醇溶性自由基的能力最強。

3 結論

本試驗采用中性蛋白酶：堿性蛋白酶=3∶1，酶底比2∶1（mg/g），底物濃度 8%的條件下，酶解溫度為 45 ℃，酶解時間為1.5 h，超聲波功率為150 W、超聲處理時間5 min為最佳提取條件，此時花生粕提取液中多肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率達到89.22%。超聲波-酶法耦合法提取條件溫和、制備的花生粕抗氧化肽含量高，有較強的抗氧化性，且醇溶性自由基DPPH自由基清除效果最好，是一種較好的常溫下提取制備花生粕抗氧化肽的方法。

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Study on Preparation of Anti-oxidation Peptides with Ultrasonic-complex Enzyme from Peanut Meal

MA Li-hua，SONG Hui，CHEN Xue-hong，CHEN Duo
（Department of Food，Engineer College of Xuzhou，Xuzhou 221008，Jiangsu，China）

Peanut meal antioxidant peptide content and DPPH free radical clearance rate as the index，the effects of different enzymolysis time，ultrasonic treatment time，ultrasonic power and enzymolysis temperature on the extraction of antioxidant peptides from peanut meal were investigated.The scavenging effects of antioxidant peptides from peanut meal on 3 free radicals were studied.The results showed that the optimal extraction conditions were：concentration of substrate 8% ，ultrasonic power150 W，ultrasonic time 5 min，enzymolysising time1.5 h，enzymolysising temperature 45℃.Under this condition polypeptide content was 7.01 mg/mL，DPPH·clearance rate was 89.22%.The peanut meal polypeptide prepared by ultrasonic and complex enzyme coupling method had strong scavenging ability to 3 kinds of free radicals，and the ability to remove alcohol soluble free radicals was strongest.

peanut meal peptides；ultrasonic-complex enzyme；extracting；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.014

2016-12-06

馬利華（1966—），女（漢），教授，碩士研究生，研究方向：農產品貯藏與加工。