基于線粒體COXⅠ基因變異探討國內外豬種的遺傳多樣性及系統進化研究

周秀敏，楊永江，畢英杰，任衛合，張 麗

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730030)

基于線粒體COXⅠ基因變異探討國內外豬種的遺傳多樣性及系統進化研究

周秀敏，楊永江，畢英杰，任衛合，張 麗*

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730030)

基于mtDNACOXⅠ基因，探討了6個豬種687個樣本(大白豬、長白豬、杜洛克、藏豬、甘肅黑豬和八眉豬)的遺傳多樣性和各豬種間的親緣關系。對各豬種樣本mtDNACOXⅠ基因構建混合池，并利用直接測序技術獲得6個豬種COXⅠ基因的序列，采用MEGA 6.0分析軟件基于Kimurk雙參數模型應用鄰接法構建系統發生樹。結果表明，6個豬種mtDNACOXⅠ基因序列共存在21個突變位點，其中8個突變為各群體特有。長白豬與杜洛克豬的多態性較豐富，含有13個相同位點的突變，核苷酸的轉換數(si)和顛換數(sv)的比值(R)分別為12和15，序列替換遠未達到飽和。而藏豬、黑豬和八眉豬的多態性較貧乏。系統進化樹和遺傳距離分析顯示，6個豬種及野豬先聚為一支而后與同屬為偶蹄目的牛、羊聚為一支，3個地方豬種間遺傳距離較近。外來豬種引入中國后主要是用作父本以提高生產速度和瘦肉率等，對本地豬種未有母系貢獻，線粒體COXⅠ基因可有效區別6個豬種的親緣關系，在一定程度上為中國地方豬品種的有效保護和合理利用提供理論依據。

豬；線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基；系統地理學

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是存在于細胞質中的共價閉合環狀雙鏈DNA分子，是獨立于細胞核染色體外的基因組，具有自我復制、轉錄、編碼等功能，同時受核DNA控制[1]。與核DNA相比，線粒體DNA具有分子結構簡單、以母系遺傳方式遺傳、核苷酸歧異度大、進化速度快等特點，可以用來研究種群進化關系和物種鑒定[2]。mtDNA拷貝遠多于核基因組DNA，核DNA降解時，仍有可能存在mtDNA。因此利用mtDNA成為判斷物種親緣關系遠近最為有力的工具。線粒體DNA輕鏈上編碼基因包括ND6和7個tRNA基因，重鏈上編碼基因包括NADH-脫氫酶的7個亞基，細胞色素b(cytb)，ATP合成酶的兩個亞基，細胞色素C氧化酶的3個亞基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ)，2個rRNA以及位于tRNAPro和tRNAPhe之間的一段不編碼任何基因的替代環區(D-loop)組成。

線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1，COXⅠ)為獨立于核基因組以外的線粒體環狀DNA編碼的呼吸鏈細胞色素氧化酶，普遍存在于原核生物和真核生物中，它的進化速度快，包含從種內到種間的遺傳進化信息，可用于比較生物體進化之間的相互關系。目前關于線粒體COXⅠ的研究多見于寄生蟲種間和種內的遺傳變異[3-5]，而有關大白豬、長白豬、杜洛克豬與青海八眉豬、甘肅黑豬、藏豬的研究還未見報道。本研究以3個地方豬種和3個國外豬種為研究對象，探討引進豬種與我國地方豬種系統地理學及起源，為我國地方豬品種的有效保護和合理利用提供有價值的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用3個引進豬種(大白豬、長白豬、杜洛克)和3個地方豬種(八眉豬、藏豬、甘肅黑豬)共687頭作為試驗群體(表1)。于仔豬出生后一周內采集耳組織，每頭仔豬剪取耳組織3～5 g，置于裝有75%乙醇的離心管中，-70 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取和DNA池的構建

采用常規的苯酚-氯仿抽提法[6]進行耳組織DNA提取，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取效果，經紫外分光光度計檢測每個DNA 樣品濃度，加雙蒸水調整DNA樣品濃度至100 ng·μL-1，各取5 μL構建DNA混合池。

1.3 引物設計、PCR擴增與測序

根據GenBank中發布的野豬線粒體COXⅠ基因序列(GenBank No.: EU333163)，應用Primer6.0軟件設計1對特異性引物，用于擴增3個引進豬種和3個地方豬種線粒體COXⅠ基因序列。其引物序列為：F: 5′-GACATTCACCACGGAACT-3′，R: 5′-GAAAGGGTAAGCCATAGAG-3′，引物由杭州金唯智生物科技有限公司合成，擴增片段為1 790 bp。PCR擴增體系總體積為20 μL：基因組DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，TaqPCR MasterMix 11.0 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR擴增程序為：94 ℃增預變性3 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后特異性良好的PCR產物經凝膠回收試劑盒(北京天根)純化后送至杭州金唯智生物科技有限公司測序。測序結果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件比對和拼接獲得豬線粒體COXⅠ基因編碼區序列。

表1 試驗豬群體、樣本數量及來源

Table 1 Population， numbers and origin of pig samples

群體Populations樣本數量Samplenumber采樣地點Collectionplace八眉豬Bameipig222青海省互助縣HuzhuCounty,QinghaiProvince藏豬Zangpig147甘肅省臨夏縣LinxiaCounty,GansuProvince甘肅黑豬Gansublackpig102甘肅省白銀市BaiyinCity,GansuProvince大白豬Largewhite72甘肅臨澤新華豬場GansuLinzeXinhuaPigFarm長白豬Landrace72甘肅臨澤新華豬場GansuLinzeXinhuaPigFarm杜洛克Duroc72甘肅臨澤新華豬場GansuLinzeXinhuaPigFarm

1.4 統計分析

應用EditSeq和MegAlign軟件進行序列比對突變位點。利用序列圖譜分析軟件BioEdit和MWSnap來測量各SNPs位點等位基因的峰高，根據公式Fi=hi/(h1+h2)估算等位基因頻率，其中Fi表示SNP位點某等位基因頻率(i=1，2)，h1和h2分別表示測序圖上該SNP等位基因1和2的峰高度。用MEGA 6.0分析軟件基于Kimurk雙參數模型應用鄰接法構建系統發生樹，分析結果探討引進豬種與中國地方豬種系統地理學及起源。

2 結果與分析

2.1 豬線粒體COXⅠ基因PCR擴增

線粒體COXⅠ基因擴增后，經1%瓊脂糖凝膠(120 V，20 min)電泳檢測后均得到一條特異性好、條帶清晰、大小為1 500～2 000 bp的目的片段，且與預期的目的片段大小一致(圖1)。

2.2 豬線粒體COXⅠ基因測序峰圖、突變位點篩查及等位基因頻率估算

將大白豬、長白豬、杜洛克、甘肅黑豬、八眉豬和藏豬線粒體COXⅠ基因與GenBank中野豬COXⅠ基因序列進行比對剪切(圖2—圖7)，分別獲得6個豬種COXⅠ基因編碼區序列1 545 bp，共存在21個突變位點，國外豬種突變位點(16個)明顯多于國內豬種(5個)，其中c.336A>T、c.433C>T這兩個突變位點為大白豬、長白豬、杜洛克所共有(表2、表3)。

M為Marker2000；1-6泳道依次為大白豬、長白豬、杜洛克、八眉豬、甘肅黑豬、藏豬M represents Marker2000; 1-6 Lane are PCR amplifications of Large white, Landrace, Duroc, Bamei pig, Gansu black pigs and Zang pigs圖1 豬線粒體COX Ⅰ基因PCR擴增電泳Fig.1 Detections of PCR products COX Ⅰ gene in pigs

圖2 甘肅黑豬COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.2 COX Ⅰ gene sequence diagram of Gansu black pigs

圖3 八眉豬COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.3 COX Ⅰ gene sequence diagram of Bamei pigs

圖4 藏豬COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.4 COX Ⅰ gene sequence diagram of Zang pigs

圖5 大白豬COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.5 COX Ⅰ gene sequence diagram of Large white

圖6 長白豬COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.6 COX Ⅰ gene sequence diagram of Landrace

圖7 杜洛克COX Ⅰ基因測序峰圖Fig.7 COX Ⅰ gene sequence diagram of Duroc

表2 不同品種豬COXⅠ基因突變位點

Table 2 Mutation sites ofCOXⅠ gene in different pig breeds

群體Populations突變位點Mutantsite大白豬Largewhitec.336A>T,c.433C>T,c.519T>C長白豬Landracec.336A>T,c.363G>A,c.381C>T,c.420A>G,c.433C>T,c.732T>C,c.750G>A,c.858T>C,c.897A>G,c.924C>T,c.1161C>T,c.1248C>T,c.1428T>C杜洛克Durocc.270C>T,c.336A>T,c.363G>A,c.381C>T,c.420A>G,c.433C>T,c.519T>C,c.732T>C,c.750G>A,c.858T>C,c.897A>G,c.924C>T,c.1161C>T,c.1248C>T,c.1428T>C,c.1442A>T甘肅黑豬Gansublackpigsc.709T>C,c.1413T>C八眉豬Bameipigsc.1107T>C,c.1482A>G藏豬Zangpigsc.945C>T

表3 等位基因頻率估算

Table 3 Estimation of allele frequency

突變位點Mutantsite杜洛克Duroc突變前頻率Beforemutation突變后頻率Aftermutation長白豬Landrace突變前頻率Beforemutation突變后頻率Aftermutation大白豬Largewhite突變前頻率Beforemutation突變后頻率Aftermutationc.336A>T0.73810.26190.75000.25000.88460.1154c.433C>T0.71050.28950.76060.23940.91300.0870c.519T>C0.72460.27540.83330.1667c.363G>A0.56180.43820.63720.3628c.381C>T0.70270.29730.73450.2655c.420A>G0.80200.19800.82760.1724c.732T>C0.62960.37040.63910.3609c.750G>A0.71430.28570.70590.2941c.858T>C0.30230.69770.27500.7250c.897A>G0.25260.74740.25000.7500c.924C>T0.83120.16880.80700.1930c.1161C>T0.25000.75000.31580.6842c.1248C>T0.35850.64150.37210.6279c.1428T>C0.23080.76920.73530.2647

2.4 系統發生樹的構建

將從GenBank檢索到的人、牛、綿羊、雞、鼠序列與本試驗6條序列一同應用MEGA6.0進行系統發育分析(圖8)。系統發生樹中長白豬及杜洛克親緣關系較近，先聚為一支，再與大白豬、八眉豬、藏豬、黑豬及野豬(EU333163.1)聚為一支，而后與同屬為偶蹄目的牛(HQ025805.1)、綿羊(KT148968)聚為一支。鼠(AC-000022.2)、人(KC292251.1)、雞(KP244335.1)各為一支，這與動物分類學基本一致。三個地方豬種間遺傳距離較近，藏豬與甘肅黑豬的遺傳距離為0.005，八眉豬與藏豬、甘肅黑豬間的遺傳距離為0.004(表4)。

圖8 應用鄰接法(NJ)構建系統發生樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by using neighbor joining method (NJ)

表4 遺傳距離

Table 4 Genetic distance

名稱Name藏豬Zangpig甘肅黑豬Gansublackpig杜洛克Duroc長白豬Landrace八眉豬Bameipigs大白豬Largewhite雞Gallusgallus牛Bostaurus人Homosapiens綿羊Ovisaries鼠Rattusnorvegicus甘肅黑豬Gansublackpig0.005杜洛克Duroc0.0220.022長白豬Landrace0.0180.0180.004八眉豬Bameipig0.0040.0040.0200.017大白豬Largewhite0.0060.0060.0160.0140.005雞Gallusgallus1.0461.0411.0861.0801.0411.052牛Bostaurus0.5750.5730.5880.5840.5730.5720.885人Homosapiens0.7590.7600.7330.7660.7600.7571.0040.688綿羊Ovisaries0.5050.5040.5080.5070.5040.5060.9630.3130.748鼠Rattusnorvegicus0.7100.7050.6980.6990.6980.6890.9700.7060.7580.660野豬Susscrofa0.0020.0020.0190.0160.0010.0041.0410.5730.7570.5040.702

3 討論

本研究對6個豬種687個樣本mtDNACOXⅠ基因構建DNA混合池，并利用直接測序技術獲得6個豬種COXⅠ基因的序列。DNA混合池是指將具有某一共同特征群體的部分個體DNA提取后經過定量和稀釋成一定濃度后，按比例或等量混合構成一個池。這種混合DNA樣品的某些多態性位點經過PCR擴增后，其產物經過電泳、測序等方法繪制等位基因型和估算等位基因頻率，確定該位點與性狀的相關性[7]。利用DNA混合池和測序技術可以快速對未知SNPs或已知SNPs等位基因頻率進行篩查，大幅度縮短了實驗周期，顯著減少了基因組DNA的消耗。但是利用這種方法進行基因頻率估算也存在一定的偏差。DNA 池進行直接測序時所要求的等位基因頻率最低10%[8]。利用測序峰高比值估算頻率不超過10%的等位基因時，準確度則會相對較低，本研究中僅大白豬c.433C>T突變后頻率低于10%(8.70%)，數據總體可靠。同時，需保證DNA定量的精確性，并且在測序反應中對背景信號應做適當的校正，存在的背景信號會對等位基因相應峰高的測量產生一定的干擾，影響估算結果[8]。

目前，線粒體DNA分析已成為研究動物起源的有力手段[9-12]，即使親源關系比較近的種屬也可以被區分開來[13]。Larson等[10]分析了世界范圍內的686個野豬和家豬個體的 D-Loop區序列，認為家豬的起源在歐亞大陸，有多個獨立的馴化中心。Jin等[14]分析了主要來自四川和西藏高原的513個豬樣本線粒體DNA高變區序列和1 394條亞洲家豬、野豬序列信息，得出分布于長江上游地區的家豬由原地馴化而來。范麗麗等[15]以豬線粒體Cybt基因序列為靶位點設計引物和探針，進行熒光定量PCR擴增，建立豬源性成分快速且準確的檢測方法。

脊椎動物線粒體 DNA的不同區域的進化速率不同，D-loop 區的進化速度最快，而COXⅠ、ND4 和Cytb基因進化速度適中。細胞色素C氧化酶(COXⅠ)作為線粒體呼吸鏈終端的一個成員，其作用是把呼吸底物的電子經過細胞色素系統直接傳遞給分子態氧。COXⅠ 已被廣泛用于分析絳蟲、靈長類[16]及鱸形目魚類[17]等分子進化規律及親緣關系的系統發育規律。陳詠霞等[18]分析了中國鯛科6屬12種魚類的COXⅠ基因序列，得出中國棘鯛屬是一個有共同祖先的單系群，屬內存在兩個平行進化的分支，且兩分支的種間關系具有明顯的分化。張順等[19]分析16 種彈涂魚的82 個體的COXⅠ基因序列，認為彈涂魚屬出現明顯分化大約發生于漸新世末期至中新世早期(23.61～15.65 Ma)。白鵬霞等[20]對采自牦牛體內的捻轉血矛線蟲線粒體COXⅠ基因部分序列進行分析，在基因和蛋白兩個層面間接印證了毛圓科內不同屬線蟲在形態和生活史方面有較多相似和不同之處。

本研究獲得豬線粒體COXⅠ基因編碼序列1 545 bp，共存在21個突變位點，有8個突變為各群體特有。楊俊靜等[21]發現民豬的COXⅠ基因序列與其他豬種相比，存在18個核苷酸突變。本研究的國內豬種無相同突變位點，國外豬種中杜洛克和長白豬有13個相同突變位點，其中杜洛克和大白豬有3個相同突變位點，大白豬和長白豬有2個相同突變位點。我國引入國外豬種與本地豬種雜交獲得雜種優勢，改善肉質，使其更加符合市場需求的同時也致使國外豬種相同堿基突變較多。近年來，利用峰高比值估算等位基因頻率的方法已被廣泛應用，李敬瑞等[22]利用測序圖中SNPs等位基因峰高的比值估算可樂豬、白香豬和大約克這3個豬品種等位基因的頻率。崔建勛等[23]利用測序圖中SNP等位基因峰高的比值估算各雞品種等位基因的頻率，其中大部分位點等位基因頻率的估算結果分別被PCR-RFLP/PCR-SSCP所驗證。本研究中利用峰高比值估算各等位基因頻率，根據堿基突變前后頻率可以將國外豬種相同部分突變分為3類。c.858T>C、c.897A>G、c.1161C>T、c.1248C>T為一類，突變后頻率高于突變前頻率；c.336A>T、c.433C>T、c.519T>C、c.363G>A、c.381C>T、c.420A>G、c.732T>C、c.750G>A、c.924C>T為一類，突變后頻率低于突變前頻率，其中，杜洛克群體中c.363G>A突變前后頻率較接近，突變前頻率為0.5618，突變后頻率為0.4382；c.1428T>C單為一類，杜洛克群體中突變后頻率高于突變前頻率，而長白豬群體中突變后頻率低于突變前頻率。國內豬種核苷酸序列位點變異表現為堿基T→C、C→T、A→G，核苷酸的替代僅為轉換；國外豬種14個相同核苷酸序列位點變異表現為堿基A→T、C→T、T→C、G→A、A→G的轉變，且核苷酸的替代主要以轉換為主。錢建新等[24]對青海牦牛樣品的線粒體COXⅠ基因部分序列進行研究，發現11個核苷酸序列位點變異，主要表現為堿基G→T、T→G、A→T 和 T→A 的轉變，核苷酸的替代同樣主要以轉換為主。轉換數(si)和顛換數(sv)的比值(R)可以用來估計序列替換的飽和程度。大白豬R值為2，長白豬R值為12，杜洛克R值為15，黃原[25]認為，如果R>2，說明序列替換遠未達到飽和，而隨著分歧時間的增加，R會降低，說明序列中多重替換數增加。

長白豬原產于丹麥，大白豬原產于英國約克郡，杜洛克原產于英國。藏豬、甘肅黑豬和八眉豬均產于我國西北地區，其生長環境相似，遺傳距離近，多態性極其貧乏，作為地方豬種種質資源得到了較好的保護。相比之下，長白豬和杜洛克線粒體COXⅠ基因具有豐富的多態性，可能是因為作為引進豬種，為提高其適應性和生產能力與地方豬種雜交所致，這也導致了長白豬和杜洛克遺傳距離近，僅為0.004。Watanabe等[26]分析了亞洲和歐洲豬的mtDNA限制性圖譜，表明大白豬同時具有歐亞兩大豬群的母性血統起源，本研究中大白豬與中國地方豬種間遺傳距離小于杜洛克和長白豬在一定程度上與其符合，該豬場為獲得較好的經濟利益，根據自身的需要展開選育，使其適應當地環境和市場需求。同時，線粒體DNA的基因結構全部是外顯子，沒有內含子，不同品種間表現出的堿基突變很可能影響蛋白質的空間結構，從而影響其功能，該基因具有作為遺傳標記的潛在可能。本研究表明，線粒體COXⅠ基因可有效區別6個豬種的親緣關系，在一定程度上為我國地方豬品種的有效保護和合理利用提供理論依據。

[1] 曹宏卿， 顧為望. FMMU白化豚鼠線粒體DNA RFLP分析研究[J].中國實驗動物學報，2005， 13(4):242-245. CAO H Q， GU W W. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)analysis of mitochondrial DNA from FMMU Albino Guinea Pig[J].ActaLaboratoriumAnimalisScientiaSinica，2005， 13(4):242-245. (in Chinese with English abstract)

[2] 張亞平， 施立明. 動物線粒體DNA多態性的研究概況[J]. 動物學研究， 1992， 13(3):289-298. ZHANG Y P， SHI L M. A survey of mitochondrial DNA polymorphism in animals[J].ZoologicalResearch， 1992， 13(3):289-298. (in Chinese with English abstract)

[3] 梁祥解， 張浩吉， 李高強，等. 犬泡狀帶絳蟲線粒體cox1和nad1基因的擴增與種系發育分析[J]. 佛山科學技術學院學報(自然科學版)， 2010， 28(5):72-76. LIANG X J， ZHANG H J， LI G Q， et al. Amplification and phylogenetic analysis of mitochondrialcox1 andnad1 genes forTaeniahydatigenain dog in Guangdong[J].JournalofFoshanUniversity(NaturalScienceEdition) ， 2010， 28(5):72-76. (in Chinese with English abstract)

[4] 郝桂英. 豬囊尾蚴西昌分離株線粒體cox1和nad1基因的序列測定與種系發育分析[J]. 中國畜牧獸醫， 2015， 42(1):61-66. HAO G Y. Sequence and phylogenetic analysis of mitochondrialcox1 andnad1 genes forCysticercuscellulosaein Xichang[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine， 2015， 42(1):61-66. (in Chinese with English abstract)

[5] 王凝， 古小彬， 汪濤，等. 基于cox1基因對中國青藏高原地區細粒棘球絳蟲遺傳多態性的研究[J].畜牧獸醫學報， 2015， 46 (3) :453-460. WANG N， GU X B， WANG T， et al. Genetic variability ofEchinococcusgranulosusdetermined by the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 gene in the Tibet Plateau of China[J].ActaVeterinariaEtZootechnicaSinica， 2015， 46 (3) :453-460. (in Chinese with English abstract)

[6] 何根林， 唐發輝， 周萍，等. 2種車輪蟲DNA抽提方法比較[J]. 安徽農業科學， 2009， 37(27):12948-12950. HE G L， TANG F H， ZHOU P， et al. Comparative research of two methods on DNA extraction ofTrichodinidssubtilisaLom[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences， 2009， 37(27):12948-12950. (in Chinese with English abstract)

[7] 黃智偉， 黃琛. DNA檢測技術研究現狀[J]. 傳感器世界， 2001， 7(1):9-14. HUANG Z W， HUANG C. Research status of DNA detection technology[J].SensorWorld， 2001， 7(1) :9-14.(in Chinese)

[8] 李樹珍， 萬慧榮， 楊光. DNA池結合DHPLC和直接測序技術在江豚SNPs檢測中的應用[J]. 獸類學報， 2009， 29(2):185-190. LI S Z， WAN H R，YANG G. Application of DNA pooling in combination with DHPLC and direct sequencing in SNPs detection of the finless porpoise[J].ActaTheriologicaSinica， 2009， 29(2):185-190. (in Chinese with English abstract)

[9] GIUFFRA E， KIJAS J M， AMARGER V， et al. The origin of the domestic pig: independent domestication and subsequent introgression [J].Genetics， 2000， 154(4):1785.

[10] LARSON G， DOBNEY K， ALBARELLA U， et al. Worldwide phylogeography of wild boar reveals multiple centers of pig domestication[J].Science， 2005， 307(5715):1618.

[11] SAVOLAINEN P， ZHANG Y P， LUO J， et al. Genetic evidence for an East Asian origin of domestic dogs.[J].Science， 2002， 298(5598):1610-1613.

[12] JANSEN T， FORSTER P， LEVINE M A， et al. Mitochondrial DNA and the origins of the domestic horse.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 2002， 99(16):10905-10910.

[13] SABETI P C， VARILLY P， FRY B， et al. Genome-wide detection and characterization of positive selection in human populations[J].Nature， 2007， 449(7164):913-918.

[14] JIN L， ZHANG M， MA J， et al. Mitochondrial DNA evidence indicates the local origin of domestic pigs in the upstream region of the Yangtze River[J].PloSOne， 2012， 7(12):e51649.

[15] 范麗麗， 李培， 傅春玲，等. 實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中豬源性成分[J]. 食品科學， 2013， 34(8):224-227. FAN L L， LI P， FU C L， et al. Detection for pig-derived components in foods by real-time polymerase chain reaction[J].FoodScience， 2013， 34(8):224-227. (in Chinese with English abstract)

[16] WU W， SCHMIDT T R， GOODMAN M， et al. Molecular evolution of cytochrome c oxidase subunit I in primates: is there coevolution between mitochondrial and nuclear genomes？[J].MolecularPhylogenetics&Evolution， 2000， 17(2):294-304.

[17] THACKER C E. Molecular phylogeny of the gobioid fishes (Teleostei: Perciformes: Gobioidei).[J].MolecularPhylogenetics&Evolution， 2003， 26(3):354-368.

[18] 陳詠霞， 吳仁協， 梁娜，等. 基于線粒體COI基因序列的中國鯛科魚類系統進化關系[J]. 海洋與湖沼， 2015， 46(3):611-619. CHEN Y X， WU R X， LIANG N， et al. Phylogenetic relationship in family sparidae of China in mitochondrial COI gene sequences[J].OceanologiaEtLimnologiaSinica， 2015， 46(3):611-619. (in Chinese with English abstract)

[19] 張順， 廖健， 郭昱嵩，等. 基于線粒體cox1基因序列的彈涂魚類系統進化關系[J]. 廣東海洋大學學報， 2017， 37(1):21-27. ZHANG S， LIAO J， GUO Y S， et al. Phylogenetic relationship of coated fish based on mitochondrialcox1 gene sequences[J].JournalofGuangdongOceanUniversity， 2017， 37(1) :21-27. (in Chinese with English abstract)

[20] 白鵬霞， 郝寶成， 陳長江，等. 捻轉血矛線蟲線粒體COXⅠ基因序列測定及進化分析[J]. 中獸醫醫藥雜志， 2016(5):13-16. BAI P X， HAO B C， CHEN C J， et al. Sequence determination and phylogenetic analysis of mitochondrial COX I gene in the Chinese wild plant[J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine， 2016(5):13-16. (in Chinese with English abstract)

[21] 楊俊靜， 別墅， 張冬杰，等. 民豬細胞色素C氧化酶Ⅰ基因的克隆、多態性檢測及冷誘導研究[J]. 吉林農業大學學報， 2012， 34(1):99-103. YANG J J， BIE S， ZHANG D J， et al. Study on cloning and polymorphism analysis of COX Ⅰ gene in Min Pig during cold induction[J].JournalofJilinAgriculturalUniversity， 2012， 34(1):99-103. (in Chinese with English abstract)

[22] 李敬瑞， 丁遠華， 張玉龍，等. 利用DNA池和測序技術快速篩查SNPs及估算基因頻率[J]. 畜牧與獸醫， 2011， 43(9):17-20. LI J R， DING Y H， ZHANG Y L， et al. Rapidly screening SNPs and estimation allelic frequencies by DNA pooling and sequencing[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine， 2011， 43(9):17-20. (in Chinese with English abstract)

[23] 崔建勛， 杜紅麗， 張細權. 利用DNA池和測序技術快速篩查SNPs及估算基因頻率[J]. 遺傳學報， 2005， 32(4):372-377. CUI J X， DU H L， ZHANG X Q. Rapidly screening SNPs and estimation allelic frequencies by DNA pooling and sequencing[J].ActaGeneticaSinica， 2005， 32(4):372-377. (in Chinese with English abstract)

[24] 錢建新， 錢和平， 徐志偉，等. 基于線粒體cox1和nad1基因對青海牦牛種系發育關系的研究[J]. 中國畜牧獸醫， 2013， 40(2):151-154. QIAN J J， QIAN H P， XU Z W， et al. Relationship between mitochondrialcox1 andnad1 genes and their phylogenetic relationships in Qinghai yaks[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine， 2013， 40(2):151-154. (in Chinese with English abstract)

[25] 黃原. 分子系統學:原理、方法及應用[M]. 北京：農業出版社， 1998.

[26] WATANABE T， HAYASHI Y， KIMURA J， et al. Pig mitochondrial DNA: polymorphism， restriction map orientation， and sequence data[J].BiochemicalGenetics， 1986， 24(5):385.

(責任編輯 張 韻)

Genetic diversity and phylogenetic relationship among domestic and foreign pig breeds based on mtDNACOXⅠ gene

ZHOU Xiumin， YANG Yongjiang， BI Yingjie， REN Weihe， ZHANG Li*

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030，China)

Based on the mitochondrial DNACOXⅠ (mtDNACOXⅠ) gene， the genetic diversity and phylogenetic relationships of 6 pig breeds (Large White pig， Landrace pig， Duroc pig， Zang pig， Gansu black pig and Bamei pig) were studied. The mtDNACOXⅠ gene sequences obtained from 6 pig breeds were sequenced and analyzed. Besides， we constructed phylogenetic tree by using MEGA 6.0 analysis software and neighbor joining method based on Kimurk two parameter models. The results showed that there were 21 mutations in sequences ofCOXⅠ (1 545 bp)， including 8 group specific mutations. Landrace pig and Duroc pig were abundant in polymorphism (13 same mutation sites)， and the ratios (R) of nucleotides’ conversion number (si) and transition number (sv) were 12 and 15， which proved sequence substitutions were far from saturation. While the polymorphisms of Zang pigs， Gansu black pigs and Bamei pigs were poor. The introduced pigs were used as sire， not dam， to improve the growth performance and lean meat percentage of the domestic pig breeds. The mtDNACOXⅠ gene can effectively distinguish the relationship between six pig breeds. This study can provide theoretical basis for the effective protection and rational utilization of pig breeds in our country.

pig; mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ; phylogeography

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.07

2017-05-14

西北民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201710742088)

周秀敏(1996—)，女，江蘇鹽城人，本科生，動物科學專業。E-mail: 1029007641@qq.com

*通信作者，張麗，E-mail: zhangli2008@aliyun.com

S828

A

1004-1524(2017)08-1271-10

周秀敏，楊永江，畢英杰，等. 基于線粒體COXⅠ基因變異探討國內外豬種的遺傳多樣性及系統進化研究[J].浙江農業學報，2017，29(8)： 1271-1280.