口蹄疫病毒分子生物學診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

口蹄疫病毒分子生物學診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

文章論述了口蹄疫病毒分子生物學診斷方法，包括基因芯片檢測方法、常規RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、環介導等溫擴增技術、核酸試紙檢測技術、賴解旋酶恒溫基因擴增技術等7種方法，對口蹄疫的診斷和防控有一定的參考價值。

口蹄疫病毒；分子生物學；診斷

口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染豬、牛、羊等70多種動物[1]。該病于1514年首次發現于意大利，目前，在非洲、亞洲、南美洲及歐洲的部分國家廣泛流行。該病傳染性強、傳播快、流行范圍廣，且能以氣溶膠的形式遠距離傳播，一旦發生，往往造成大流行，不易控制和消滅，不僅給畜牧業造成巨大的經濟損失，還影響社會穩定、國際貿易及國家聲譽。我國是世界上口蹄疫多發國家之一，且疫情復雜，這與我國的地理環境密切相關，鄰國如越南、緬甸、泰國等國都有口蹄疫流行。世界各國對口蹄疫的防控都十分重視，此病已成為國際重點檢疫對象。世界動物衛生組織(OIE)將口蹄疫列在15個A類動物疫病之首，我國政府也將其排在一類動物傳染病的第一位?？谔阋咭荒晁募揪砂l病，多發于冬、春寒冷季節[2]。本文就口蹄疫病毒的分子生物學診斷方法研究進展進行綜述，以期為口蹄疫的快速診斷和防控提供參考。

1 分子生物學診斷

1.1 基因芯片檢測

基因芯片檢測技術是在芯片上排列著眾多一定堿基順序的DNA探針，通過與堿基互補序列的單鏈目標DNA片段雜交，捕捉相應的DNA分子。檢測系統再將雜交過程或結果轉化為可觀測的信號，進入信號采集分析系統[3]。楊林等[4]根據FMDV基因組序列保守區，設計合成2對引物，通過RT-PCR方法篩選出特異引物，用Cy3標記下游引物5′端，針對這個基因片段，設計合成4條寡核苷酸探針，開展靶基因擴增和克隆、陽性質粒構建、芯片雜交與反應條件優化以及芯片靈敏度和特異性分析等試驗研究，建立FMDV的基因芯片檢測方法。相磊等[5]為建立FMDV不同血清型與基因型的基因芯片檢測方法，設計針對O型8個基因型、A型3個基因型和亞洲1型的特異性探針。從美國GenBank與英國世界口蹄疫參考實驗室基因庫下載了O型、A型和亞洲1型FMDV的VP1基因序列547條。對每一種血清型序列用DNA Star軟件ClastalW程序進行多重比對，做系統發育分析并進行基因分型。用生物學軟件BioSun 2.0建立基因型數據庫，設計每一基因型的特異性探針。共設計出104條候選探針，通過芯片試驗篩選出12條特異性探針。以各型特異性探針所對應的靶序列模板做10倍系列稀釋進行PCR擴增，擴增產物與探針雜交，驗證各探針的靈敏度。對O型SEA、Euro-SA、ME-SA、WA4個基因型的各條探針的靈敏度進行了檢驗，結果這些探針能夠檢測到102數量級拷貝數的陽性靶標。

1.2 常規RT-PCR 方法

RT-PCR方法是根據目的片段序列設計引物，借助儀器和相關聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。張書光等[6]設計合成一套引物，通過反應條件的優化，建立了一種RTPCR的方法，用于檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原，并用該法檢測患病豬的頜下淋巴結和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)等樣品。結果表明，該方法可快速靈敏檢測出豬的頜下淋巴結和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物中的FMDV，并具有較好的特異性和重復性。結論：建立了一種RT-PCR檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原的方法。

1.3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優點，是在同一反應體系中，加入多種引物，同時檢測2種或2種以上的病毒RNA，目前已廣泛應用于臨床疾病的快速診斷。張彥婷等[7]根據口蹄疫病毒VP1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計4條特異性引物，通過對退火溫度等反應條件進行優化，建立能夠同時擴增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測方法。結果表明，建立的方法最低可以檢測出約含1pg/μL的病毒樣品，該方法對豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒等其他相關病毒的檢測結果均為陰性，特異性良好。秦敏等[8]針對藍舌病病毒(BTV)NS3基因、FMDV 3D基因、小反芻獸疫病毒(PPRV)N基因和水皰性口炎病毒(VSV)N基因序列設計引物，優化反應體系和擴增條件，建立了一種同時檢測4種病毒的多重PCR方法。對建立的多重PCR檢測方法的特異性及敏感性進行檢驗，結果表明建立的多重PCR檢測方法敏感性強、特異性良好，對4種病毒的最低檢出限分別為PPRV 103copies/μL、BTV 103copies/μL、VSV 103copies/ μL和FMDV 102copies/μL。

1.4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR技術是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續監測熒光信號強弱的變化來測定特異性產物的量，不需要分離擴增產物，即能準確定量起始模板數[9]。李金海等[10]根據FMDV聚合酶3D基因序列比對結果，設計特異性引物和MGB探針，建立檢測FMDV的一步法熒光定量RT-PCR檢測方法。結果顯示，該法能特異性檢測A型、O型、Asia1型FMDV，而對豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒、豬狂犬病毒、豬乙型腦炎病毒等檢測結果均為陰性，構建的熒光定量標準曲線Ct值與模板濃度呈良好的線性關系，檢測質粒的敏感性可達83.4copies/ μL，檢測病毒RNA的敏感性可達7.1fg/μL，比多重RT-PCR敏感性高10倍，對4份樣品進行5次批內和批間重復檢測，檢測結果變異系數均小于2%。王乃福等[11]根據口蹄疫病毒3D蛋白編碼基因、水皰性口炎病毒N蛋白編碼基因和豬水泡病病毒VP1蛋白編碼基因的高保守區設計特異性引物和探針，對3種動物病毒進行多重熒光定量RT-PCR擴增。結果經過擴增，可以同時檢測口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒和豬水皰病病毒，而其他參試病原均無擴增信號，顯示其良好的特異性。對口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒的最低檢測限分別達到101、102、102個質?？截悵舛?。宋爽等[12]根據高度保守的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的5'UTR基因、牛傳染性支氣管炎病毒(IBRV)的gB基因和FMDV的3D基因，分別設計了3對對應的特異性引物和3種不同發光基團標記的TaqMan探針，建立了同時檢測這3種病毒的多重熒光定量PCR的方法。并對其反應條件進行優化。結果表明，該多重熒光定量PCR方法能夠特異性檢測出BVDV、IBRV和FMDV，而對BTV等檢測結果均為陰性，對BVDV、IBRV、FMDV的最低檢測量分別為194copies/μL、208copies/μL和150copies/μL。而且組內和組間變異系數均低于0.85%。

1.5 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術(LAMP)是在等溫條件進行擴增反應?；虻臄U增和產物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，可在15～60min擴增109～1010倍，可只通過擴增產物的有無來判別。秦智鋒等[13]設計了6條針對FMDV 3D基因的8個位點的特異性引物，建立了口蹄疫病毒RTLAMP檢測方法的。所建立的檢測方法靈敏度高，與實時熒光RT-PCR靈敏度相當，且具有特異性，對其他水皰性疾病病原體檢測均為陰性，而且簡單，不需要復雜的儀器，常規水浴鍋在63.5℃即可進行，肉眼可直接觀察檢測結果。李健等[14]利用逆轉錄環介導等溫核酸擴增技術(RT-LAMP)，建立了口蹄疫病毒快速檢測方法，同時評價了該方法的靈敏性和特異性。結果表明，根據蹄疫病毒多聚蛋白基因保守區段設計的LAMP引物能夠在65℃下，1h內實現目標核酸區段的大量擴增，檢測結果可直接用肉眼判斷。該檢測體系具有極高的特異性，只能檢測到目標病毒，與其他類似病毒如豬水皰病病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒等無交叉反應，可檢測到10-5稀釋度的目標病毒核酸量，比普通RTPCR的靈敏性高100倍，比熒光PCR高10倍。

1.6 核酸試紙檢測技術

核酸試紙檢測技術是將核酸探針標記與試紙條相結合進行生物學檢測，是核酸檢測的新領域。龔真莉等[15]用RT-PCR方法獲得FMDV3D核苷酸片段，在引物中設計了靈敏度高、特異性好的核酸探針-生物素和地高辛，使擴增產物結合探針。利用膠體金的放大原理將鏈霉親和素與金顆粒形成膠體金混合物，從而與RT-PCR產物中的生物素探針結合。硝酸纖維素膜上端標記生物素化山羊抗兔IgG作為指控條帶，下端標記抗地高辛抗體以捕獲RT-PCR產物中的地高辛探針。組裝金標試紙條，檢測RT-PCR產物，結果表明該核酸試紙條可以檢測到0.3×10-3～3×10-3μg/μL，敏感性高于瓊脂糖凝膠電泳，兩種方法的符合率高。

1.7 賴解旋酶恒溫基因擴增技術

賴解旋酶恒溫基因擴增技術(HDA)是一種新興、簡單、有效的基因擴增技術，其擴增原理是先用解旋酶解開雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結合蛋白(SSB)與模板單鏈結合，使模板單鏈處于單鏈狀態并保護它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴增。新生成的dsDNA產物作為底物進入下一輪擴增[16]。金靜維等[17]針對FMDV編碼3D蛋白(RNA聚合酶)的保守序列設計特異性引物，建立了FMDV逆轉錄解旋酶恒溫擴增技術(RT-HDA)快速檢測方法。該方法可在65℃下，120min內實現對口蹄疫病毒保守序列的大量擴增。該方法可檢測到0.2ng的FMDV核酸量，比普通RT-PCR高10倍，具有極高的特異性，除了能對FMDV核酸進行擴增外，對其他臨床癥狀與口蹄疫類似的病毒，如水皰病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒和水皰性口炎病毒的核酸，則不能擴增出目的片段。

2 小結

口蹄疫防控工作是一項涉及畜牧業安全生產的大事，也是保障人們食品安全和國家聲譽的重要問題。目前，我國是疫區國家，國內及周邊疫情都很復雜，口蹄疫的防控形勢仍比較嚴峻，口蹄疫的正確診斷是進行防控的前提和基礎，因此，建立早期、快速而準確的檢測方法從而采取相應的防控措施才能控制口蹄疫的流行。目前已經建立了FMDV多種分子生物診斷方法，但這些方法各有利弊，如基因芯片檢測技術優點是一次可檢測大量樣品和大量疾病，檢測速度快、靈敏度高，缺點是一次性需要大量的資金投入，費用高，不適合基層實驗室應用，且特異性不高，容易出現假陽性。常規RT-PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能準確定量，且敏感性有限。熒光定量RT-PCR方法雖然克服了常規RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合大面積推廣應用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應用，但靈敏度太高，易出現假陽性結果。文中提到的核酸試紙檢測技術，需要對樣品進行PCR擴增，且需要對樣品進行純化，對技術要求較高，基層部門不易掌握。隨著分子生物學技術的不斷發展，筆者認為恒溫基因擴增技術與試紙檢測技術結合進行檢測是未來分子檢測技術發展的新方向，目前對其他疾病的檢測方面已經研制出了基因試紙卡檢測盒，是將LAMP檢測與試紙檢測技術相結合的新技術，兼具二者的優點，操作簡單，全程時間短，又能避免假陽性的出現，不需要冷凍保存，易保存和運輸，適合基層獸醫部門應用，基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡易核酸制備設備是未來口蹄疫檢測試劑的研究方向?！?/p>

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山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17)。