熱誘導牛奶中乳清蛋白與酪蛋白膠束反應的機理研究

譯/劉海燕 校/顧佳升

（1 新希望乳業股份有限公司；2 上海奶業行業協會）

熱誘導牛奶中乳清蛋白與酪蛋白膠束反應的機理研究

譯/劉海燕1校/顧佳升2

（1 新希望乳業股份有限公司；2 上海奶業行業協會）

將牛奶加熱到90 ℃，然后采用具體界定反應的最終產物的方法來研究在熱誘導條件下，乳清蛋白和酪蛋白膠束之間的相互作用機理。在脫脂乳里添加了不同數量的乳清蛋白，加熱后分別查驗脫脂乳和依然懸浮分散在其中的酪蛋白膠束，由此獲得了牛奶在熱誘導條件下，“蛋白質-蛋白質”相互之間作用機制的確切信息。以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與κ-酪蛋白的比率，以及在酪蛋白膠束顆粒中發現的α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的比率，作為評估牛奶中發生熱誘導反應程度的指標物。結果顯示，在低溫（70～90 ℃）間歇式加熱條件下，各種乳清蛋白相互作用，形成多類可溶性的復合物，在熱誘導過程中，擔任了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進一步與酪蛋白膠束發生反應的中間體角色。對于乳清蛋白與酪蛋白膠束之間發生的任何交聯反應而言，β-乳球蛋白的存在都是必需的；此外還發現，加熱后出現在酪蛋白膠束顆粒中β-乳球蛋白的數量，似乎受到酪蛋白膠束表面結合位點數量的限制，而這些結合位點的分布是離散的。

熱誘導牛奶；乳清蛋白；酪蛋白；機理

在熱處理過程中，牛奶發生著各種反應，包括乳清蛋白的變性和聚集，以及乳清蛋白與酪蛋白膠束和脂肪球之間多種復合物的形成。關于α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的變性現象，目前已經通過多種模擬系統有了廣泛的研究。然而，即使理解了單個蛋白質的變性機理，也只是對牛奶的熱處理期間所發生的復雜系列反應的初始階段情況有初步的了解。基于這個原因，目前需要一個不同的方法，旨在確定中間體的形成，以及環境條件的變化對它們的影響效果，即在加熱過程中“蛋白質-蛋白質”是如何相互作用的。

當全脂奶被加熱后，乳清蛋白不僅與酪蛋白膠束相互作用，而且與脂肪球相互作用。最近的研究已經證明，雖然乳清蛋白與乳脂肪球結合的速度很快但數量較少，如果與結合于酪蛋白膠束上的數量相比較，在乳清蛋白和酪蛋白膠束之間形成的復合物，是迄今為止熱誘導反應的重要的中間產物，并且存在于β-Lg（β-乳球蛋白）天然結構中的游離巰基，似乎在相互作用過程中發揮了重要的作用。在牛奶熱處理過程中形成的主要復合物是“β-Lg/κ-酪蛋白復合物”。研究發現，不僅β-Lg，α-La也參與了與酪蛋白膠束的反應。已有報道，當存在β-Lg時，α-La的變性程度會增加。也有報道指出，α-La的自身變性其實是半可逆的。

盡管對牛奶的熱處理已經有了廣泛的研究，但是目前關于在熱誘導下，α-La和β-Lg與酪蛋白膠束之間的相互作用機制細節并不清楚。本文描述了在牛奶溫度高達90℃的加熱過程中，就添加乳清蛋白到脫脂乳中的效果，以及對依然懸浮分散的酪蛋白膠束的影響，探討α-La、β-Lg和酪蛋白膠束顆粒之間的相互作用問題。

1 試驗設計

從圭爾夫大學的Elora研究站收集新鮮的全脂牛奶。在加入0.2 g/L的疊氮化鈉作為防腐劑后，通過低速離心（3 000 g，20 min）將牛奶脫脂。再通過離子交換層析制備單個α-La和β-Lg，用4 L 20 mmol/L的Tris pH值緩沖液（0～1 M NaCl梯度）洗脫。透析后，將分離的蛋白質凍干并在加熱前以干粉形式加入到脫脂乳中。在熱處理之前，將純化的α-La和β-Lg加入到脫脂乳中，在改變了原奶蛋白質濃度的情況下，研究α-La、β-Lg和酪蛋白膠束之間的熱誘導復合物的組成所產生的影響。此外，還采用超濾牛奶的方法處理懸浮的酪蛋白膠束。將未處理過的脫脂乳用60 000 g離心40 min的方法，獲得凈化的酪蛋白膠束。使用10 000 Da截留膜的實驗室超濾裝置制備超濾液。在熱處理之前加入并分散了不同數量的純化α-La和β-Lg。

將樣品在溫控水浴（70～90℃）的試管中加熱不同時間。熱處理后，樣品在冰浴中快速冷卻。

采用超速離心方法，從熱處理過的樣品中分離獲得在熱誘導下乳清蛋白和酪蛋白膠束之間相互作用所形成的最終復合物，采用Corredig和Dalgleish在1996年所述的SDS-PAGE電泳法進行分析，根據α-La和β-Lg與κ-酪蛋白相結合比率進行定量，將這些比率關系作為乳清蛋白和酪蛋白之間的反應指數。此外，有報道建議使用α-La/β-Lg作為一種評估脫脂乳經受熱處理強度的方法，用以研究α-La / β-Lg與乳中蛋白質濃度比率的變化規律。

2 結果和討論

當牛奶經過75～90 ℃的間歇加熱處理時，乳清蛋白與酪蛋白膠束的相互作用程度隨時間和溫度的增加而加劇。通常與膠束顆粒相結合的乳清蛋白數量，隨著加熱時間的延長而增加至最大值，并且溫度越高，蛋白質之間的相互作用越快。早前的研究表明，環境條件的變化強烈影響α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的熱誘導相互作用。方差分析顯示，不僅加熱的時間和溫度，而且脫脂乳中存在的乳清蛋白數量，都將顯著影響與酪蛋白膠束相結合的α-La/κ-酪蛋白和β-Lg/ κ-酪蛋白的數量。

熱處理后觀察到的α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結合情況，與Law等在1994年研究結果相一致。圖1為加熱溫度為80 ℃，保持不同時間的脫脂乳，與酪蛋白結合的重量比率變化情況，采用4 次獨立試驗結果的平均值，計算黑塊、左坐標為α-La/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓、右坐標為β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率。結果顯示，在低于90 ℃的加熱過程中，蛋白質不僅與膠束相互作用，而且具有非常相似的動力學行為（圖1）。

溫度（90 ℃）似乎在反應機制中是一個關鍵臨界值，與表達乳清蛋白變性動力學的阿倫尼烏斯圖斜率變化一致。當牛奶在低溫下加熱時，兩種乳清蛋白質的變化情況表現相似，其在酪蛋白膠束顆粒中的數量，與它們在原奶中的濃度直接相關。圖2為加熱溫度為80 ℃的脫脂乳，隨著保持時間的增加，與酪蛋白結合的乳清蛋白/κ-酪蛋白的重量比率也在變化，黑塊所示2 g/L β-Lg脫脂乳中β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓所示2 g/L α-La脫脂乳中α-La/κ-酪蛋白的重量比率。顯示結果也證實了上述假設。

圖1 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨著保持時間的變化與酪蛋白結合的重量比率變化情況

圖2 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨保持時間的變化，與酪蛋白結合的乳清蛋白/κ-酪蛋白比率的變化情況

當添加2 g/L α-La中時，α-La和β-Lg的濃度相當，具有相同的相互作用動力學，處理后與膠束顆粒相結合的數量也相似。加入2 g/L β-Lg的脫脂乳在80 ℃加熱（圖2），幾分鐘后即達到β-Lg /κ-酪蛋白的最大值。而β-Lg /κ-酪蛋白所達到的高數值，與對照奶樣品所達到的穩定值并沒有顯著的不同。該結果表明，在酪蛋白膠束顆粒的表面上只有一定數量的位點可以用于與β-乳球蛋白發生相互作用。α-La的作用行為不同于β-Lg，在相同條件下加熱后，α-La即可以增加與酪蛋白膠束顆粒相結合的數量。

加熱后膠束顆粒中兩種乳清蛋白的存在及其在低溫（直到90℃）下加熱時的類似動力學行為表明，乳清蛋白內部可能形成了可溶性的聚合物，即兩種乳清蛋白——α-La和β-Lg，彼此反應，形成中間體復合物，再與酪蛋白膠束發生相互作用。現已知在低溫下，β-Lg需要時間改變結構，可能是α-La參與酪蛋白膠束反應的原因。在加熱下依然懸浮分散的酪蛋白膠束，添加不同數量的α-La和β-Lg，結果表明盡管α-La的存在并不影響β-Lg與酪蛋白膠束的結合作用，但β-Lg與酪蛋白膠束的結合需要 α-La。

圖3顯示80 ℃加熱后在酪蛋白膠束顆粒中α-La/β-Lg的比率，與脫脂乳中α-La和β-Lg濃度的函數關系。添加不同數量乳清蛋白的脫脂乳，在同為80 ℃但不同保持時間條件下，與酪蛋白膠束結合的α-La/β-Lg的比率，三者之間的函數關系，其中黑圓為對照樣脫脂乳，黑塊為添加2 g/L α-La的脫脂乳，白圓為添加2 g/L β-Lg的脫脂乳，白塊為各添加1 g/L α-La和β-Lg的脫脂乳。

對沒有添加蛋白質的脫脂乳進行的加熱試驗中，α-La/ β-Lg的比率反映了它們的原始組成。當添加2 g/L α-La時，兩種乳清蛋白具有相似的濃度，與酪蛋白膠束相結合的α-La/ β-Lg的比率高于對照樣品中的比率，并且達到約0.8 mg α-La/ mg β-Lg。當1 g/L α-La和1 g/ L β-Lg同時添加到脫脂乳中時，α-La/β-Lg的比率雖然與對照樣品相比是明顯不同的，然而向脫脂乳中加入更多的α-La時，再也沒有顯著的效果差異了（圖3）。該結果證實了如下假設，即只存在數量有限的離散分布的結合位點可用于β-Lg與酪蛋白膠束的相互結合。此外，額外添加β-Lg到脫脂乳中，如果與對照樣品比較，并不能有意義地改變與酪蛋白膠束結合的α-La和β-Lg的比率。筆者對依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束，再加入不同量的乳清蛋白進行了多次研究，得到了上述結論。

圖3 不同數量乳清蛋白脫脂乳，在不同保持時間下，與酪蛋白膠束結合的α-La/β-Lg比率之間的函數關系

總之，在加熱（低溫間歇加熱）條件下，認識到了兩種主要的相互作用：一是β-Lg與酪蛋白膠束通過κ-酪蛋白結合的直接相互作用；二是α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結合，是通過在溶液中這兩種乳清蛋白之間的反應所形成的中間體來實現的。對脫脂乳和依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束兩種物料所進行的熱處理試驗，都表明了能夠與酪蛋白膠束相互結合的β-Lg數量，受可用的結合位點數量的限制。能夠與酪蛋白膠束顆粒相結合的α-La的數量，似乎只取決于其在奶中的濃度。C

英文原文：Corredig M，Dalgleis D G. The mechanisms of the heat-induced interaction of whey proteins with casein micelles in milk[J]. International Dairy Journal，1999，9 （3–6）：233-236.

2017-06-19）

劉海燕，博士，高級工程師，從事乳制品生產管理、質量控制、乳品技術研究工作。

校者簡介：

顧佳升（1948-），男，學士，高級工程師，研究方向為乳品加工及檢驗。