某豬場PCV2、PRRSV和附紅細胞體多重感染的診斷

王招弟，吳好葉，嚴莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

某豬場PCV2、PRRSV和附紅細胞體多重感染的診斷

王招弟，吳好葉，嚴莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

2017年4月以來，貴州某豬場的保育豬陸續開始發病，發病率約為30%，病死率約16%。據述該豬場發病豬主要癥狀為高燒（41 ℃以上）、氣喘和腹瀉等，將送檢發病豬解剖后發現其組織器官中淋巴結腫大、出血、腎臟有囊腫及黃染現象，白斑腎特征明顯，肺臟出血間質性肺炎特征明顯，脾臟有瘀血梗死現象，其他臟器未見明顯眼觀病變。為了對其進行確診，本實驗室對上述送檢病料進行了實驗室檢測，結果顯示該豬場發病豬存在豬圓環病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和附紅細胞體的多重感染。

1 材料

1.1 病料

系分別采自2頭發病仔豬的組織病料（肝、腎、肺、淋巴結和脾臟等臟器）。

1.2 主要試劑

TaKaRa MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.4.0、Prime-Script One Step PT-PCR Kit VER.2.0、DL2000皆購自大連寶生物公司；其他化學試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 病料的處理及核酸的提取

對送檢樣品進行剖檢，如圖1所示。分別取適量剖檢病豬的肝、腎、肺臟、淋巴結和脾臟進行碾磨勻漿，反復凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清，用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進行核酸的提取。

圖1 解剖病例觀察結果

2.2 附紅細胞體檢測

采集送檢2頭發病豬血液，分別涂片、處理后，于400倍鏡下觀察。

2.3 病原核酸檢測

分別用本實驗室設計的PCV2(上游引物：5’－TCGGAATT C A T G T C T A A C G G T T C T－3’，下游引物為：5’-ACGCTCGAGTTAGACTAAATGAAG－3’。)和PRRSV（上游引物：5′-CCCAAGCTTCCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTT-3′，下游引物：5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′）的特異性引物，以提取的核酸為模板，參照一步法RT-PCR試劑盒說明書，對PCV2、PRRSV進行核酸檢測，其反應總體系為50μL：2×1 StepBuffer 25μL，模板7.0μL，上下游引物各1.0μL，Prime-Script 1 Step Enzyme Mix 2μL， RNase Free H2O 14μL；參照PCR試劑盒說明書，對PCV2和PRRSV進行核酸檢測，其反應總體系為50μL：ddH2O 10μL，2×GC BufferⅠ25μL，dNTP 8.0μL，上下游引物各2.0μL，模板2μL，Taq酶1μL。上述反應程序均為：50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 病原檢測結果

3.1 附紅細胞體檢測

將送檢的兩份血液分別涂片、處理后，于400倍鏡下觀察，發現a管血紅細胞表面及血漿中有游動的各種形態的附紅小體，紅細胞呈星形或不規則的多邊形；b管血紅細胞正常，未見有附紅細胞體，如圖2。

3.2 組織樣品的病原檢測

根據檢測要求，提取混合組織中核酸，應用一步法RT-PCR試劑盒，對PRRSV和PCV2進行檢測。檢測結果顯示，混合組織中PCV2和PRRSV呈陽性，結果見圖3。

圖2 送檢血液樣附紅細胞體檢測結果（400倍鏡下）

圖3 送檢樣本病原檢測結果

4 結果分析及建議

病原檢測結果表明，送檢病豬混合組織中PCV2和PRRSV均呈陽性，其中一份血液樣品存在附紅細胞體感染。由于PRRSV、PCV2常常導致嚴重的免疫抑制從而繼發其他病原感染，影響生長性能，且急性PRRS常引起豬群大規模死亡。通過臨床發病情況及組織病理特征可知，豬群系因免疫豬瘟疫苗引起應激，進而誘發豬藍耳病疫情，其中豬圓環病毒和豬藍耳病毒在免疫豬瘟疫苗前應該已經潛伏感染豬群，并使豬群處于多系統衰竭的亞臨床病癥；同時部分發病豬還誘發附紅細胞體感染，使本次疫情更加復雜。故建議結合豬場實際情況，加強PRRSV和PCV2的疫苗免疫及日常保健預防；對于豬附紅細胞體病，應加強飼養管理，保持豬舍、飼養用具衛生，減少不良應激等是防止該病發生的關鍵，夏秋季節要經常噴灑殺蟲藥物，防止昆蟲叮咬豬群，切斷傳染源，在實施諸如預防注射、斷尾、打耳號、閹割等飼養管理程序時，均應更換器械、嚴格消毒，購入豬只亦可進行血液檢查，防止引入病豬或隱性感染豬。

2017-05-24）

貴州大學SRT項目, 貴大SRT字(2015)093號

王招弟（1993—），女，在讀學士，研究方向：動物傳染病病原分子生物學。E-mail: 1458316517@qq.com

*通訊作者： 曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導師，從事動物傳染病病原分子生物學研究。E-mail:zyzeng@gzu.edu.cn