沙格列汀聯合二甲雙胍對2型糖尿病小鼠腎臟保護作用及對氧化還原平衡的影響

武曉影，溫文杰，張啟倫，薛競帆，周 婉，葉山東

(中國科學技術大學生命科學與醫學部，中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)內分泌科，糖尿病研究院，安徽 合肥 230051)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病主要微血管并發癥之一，已成為終末期慢性腎病的首要病因[1]，氧化應激在DKD發病機制中占據重要地位[2]。二甲雙胍和DPP-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制劑是目前指南推薦廣泛使用的抗糖尿病藥物，它們對DKD均有一定的療效，其機制是多因素的，包括抗凋亡、抗纖維化、抗炎和減輕內質網應激等[3]，最近一些動物實驗和臨床試驗顯示其機制尚與減輕機體氧化應激有關[4-5]，因此，我們假設二甲雙胍聯合DPP-4抑制劑(如沙格列汀)治療糖尿病可協同增強其減輕氧化應激的效果，進而對腎臟發揮更加有效的保護。本研究擬通過對2型糖尿病(T2DM)小鼠聯合使用二甲雙胍與沙格列汀，觀察藥物聯合應用對T2DM小鼠腎臟保護作用及其對機體氧化還原平衡的影響，以期為DKD的防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料8周齡SPF級C57BL/6J小鼠(批號N002013)51只，體質量(20～23)g，購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司；小鼠飼養條件為：12 h明/暗交替規律照明、環境溫度(19±1)℃、濕度(48±10)%；鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)(貨號MB1227-1)購自大連美侖生物技術有限公司；格列苯脲(貨號10238-21-8)購自天津太平洋制藥有限公司；二甲雙胍(貨號02000913)和沙格列汀(貨號122616)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHbA1c)(貨號MM-0159M2)和白蛋白(albumin，Alb)(貨號S0189O-1)試劑盒購自江蘇雨桐科技有限公司；尿肌酐(urinary creatinine，Ucr)ELISA試劑盒(貨號C011-2-1)購自南京建成生物工程研究所；小鼠8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)(貨號MM-0221M1)和小鼠8-異前列腺素(8-iso-prostaglandin，8-iso-PG)ELISA試劑盒(貨號MM-0334M1)購自江蘇酶免實業有限公司；總超氧化物歧化酶(glycosylated hemoglobin，SOD)活性檢測試劑盒(貨號S0101M)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)檢測試劑盒(貨號S0053)購自上海碧云天生物技術有限公司；酶標儀購自賽默飛世爾科技Thermo；超聲波細胞粉碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；IX51倒置顯微鏡式基礎型顯微鏡購自奧林巴斯(北京)銷售服務有限公司；高速冷凍離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；-80 ℃冰箱購自日本的三洋公司；4 ℃冰箱購自中國美菱公司。

1.2 實驗方法

1.2.1模型建立與分組 小鼠隨機分為常規飼料喂養的正常對照組(NC，n=8)和高脂飼料喂養的高脂喂養組(含10%豬油和2%膽固醇的常規飼料)(n=43)。4個月后，高脂喂養組一次性腹腔注射小劑量STZ(50 mg·kg-1，溶解于0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液中，pH=4.2)，每天1次，連續注射3 d，NC組注射等量枸櫞酸緩沖液，建立T2DM模型。1周后經尾靜脈檢測FBG≥16.7 mol·L-1為造模成功，共40只，隨機分為糖尿病對照組(T2DM組)、格列苯脲組(Gli組)、二甲雙胍組(Met組)、沙格列汀組(Sax組)和沙格列汀聯合二甲雙胍組(S+M組)，每組各8只，繼續高脂飼料喂養。NC組與T2DM組每天清晨灌胃滅菌雙蒸水100 μL，Gli組、Met組、Sax組和S+M組每天清晨分別灌胃格列苯脲2.5 mg·kg-1·d-1、二甲雙胍250 mg·kg-1·d-1、沙格列汀5 mg·kg-1·d-1和沙格列汀5 mg·kg-1·d-1與二甲雙胍250 mg·kg-1·d-1混合液。干預治療8周后稱重，末次給藥12 h后，禁食6 h，代謝籠中禁食不禁水，收集4 h隨機尿液0.5～1 mL，置于-80 ℃冰箱，以檢測尿Alb、Cr、8-OHdG和8-iso-PG。尿液標本收集結束后，采取摘眼球法取血以測定FBG和GHbA1c。小鼠灌流后取腎臟組織，放入液氮中，以測定SOD、GSH、GSSG及腎臟病理形態觀察。灌胃給藥期間，T2DM組、Gli組和S+M組小鼠各死亡1只，其余組均正常存活。

1.2.2生化指標檢測 葡萄糖氧化酶法測定FBG，ELISA法檢測GHbA1c、尿Alb、8-OHdG、8-iso-PG以及小鼠腎組織SOD、GSH和GSSG，苦味酸法測定尿肌酐(Ucr)，計算Alb/Ucr(UACR)、8-OHdG/Ucr(UOCR)、8-iso-PG/Ucr(UPCR)，以排除尿液濃度的影響。

1.2.3腎臟病理形態觀察 腎臟組織采用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定，質量濃度為200 g·L-1的蔗糖脫水處理，OCT包埋，冰凍切片。用蘇木精和伊紅(HE)對5 μm厚的切片進行常規組織病理學診斷。

2 結果

2.1 各組體質量和血糖比較與NC組比較，T2DM、Gli、Met、Sax和S+M組體質量顯著下降(P<0.05)，GHbA1c和FBG明顯升高(P<0.05)；與T2DM組比較，Gli、Met、Sax和S+M組體質量明顯升高(P<0.05)，GHbA1c、FBG明顯降低(P<0.05)；與Gli組比較，Met、Sax和S+M組體質量、GHbA1c和FBG差異無統計學意義(P>0.05)；與Met和Sax單藥組比較，S+M組體質量輕度升高，GHbA1c、FBG輕度降低，但差異無統計學意義(P>0.05)(Tab 1)。

Tab 1 Comparison of body weight and blood sugar indexes among

2.2 各組UACR和氧化應激指標的比較與NC組比較，T2DM組、Gli、Met和Sax組UACR、UOCR和UPCR水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，S+M組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)；與T2DM組比較，Gli、Met、Sax和S+M組UACR、UOCR和UPCR水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)；與Gli組比較，Met、Sax和S+M組UACR、UOCR和UPCR降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)；與Met和Sax單藥組比較，S+M組UACR、UOCR和UPCR降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)(Tab 2)。

Tab 2 Comparison of UACR、UOCR、UPCR and SOD among

2.3 各組氧化還原平衡指標的比較與NC組比較，T2DM、Gli、Met和Sax組GSSG水平升高(P<0.05)，GSH水平和GSH/GSSG比值下降(P<0.05)，S+M組GSH和GSSG水平差異無統計學意義(P>0.05)，GSH/GSSG比值下降(P<0.05)；與T2DM組比較，Gli、Met、Sax和S+M組GSSG水平下降(P<0.05)，GSH水平和GSH/GSSG比值升高(P<0.05)；與Gli組比較，Met、Sax和S+M組GSSG水平下降(P<0.05)，GSH水平和GSH/GSSG比值升高(P<0.05)；與Met和Sax單藥組比較，S+M組GSSG水平下降(P<0.05)，GSH水平和GSH/GSSG比值升高(P<0.05)(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of GSH、GSSG and

2.4 糖尿病各組腎損傷指標的相關性分析相關性分析顯示糖尿病各組UACR與UOCR和UPCR呈高度正相關(相關系數分別為r=0.972和0.971，P<0.01)，與SOD和GSH/GSSG呈負相關(相關系數分別為r=0.743和0.867，P<0.01)(Tab 4)。

Tab 4 Correlation analysis of renal injury index in diabetic groups

2.5 各組腎臟組織病理形態變化冷凍切片HE染色(400×)觀察，NC組小鼠腎小管及腎小球結構清晰，未見間質炎性細胞浸潤，T2DM組小鼠腎組織中腎小球和腎小管肥大、結構模糊，系膜細胞增殖，腎間質有炎細胞浸潤，Gli、Met、Sax和S+M組上述病理變化較T2DM組均明顯減輕，S+M組較Met和Sax組上述病理變化進一步有所改善(Fig 1)。

Fig 1 Histological changes of mouse kidney sections in each group(400×)

3 討論

隨著糖尿病患病率和患病人數的增加，DKD所導致的終末期腎病和透析的人數正逐步增加[6]。糖尿病患者一旦腎臟受損，病變常將持續進展，其經典演變過程為[7]：腎小球高濾過，微量白蛋白尿，臨床顯性蛋白尿和腎小球硬化伴或不伴腎小管-間質病變，最終導致終末期腎病。氧化應激在糖尿病腎損傷中起著重要的介導作用[8]。

二甲雙胍和DPP-4抑制劑如沙格列汀已被臨床廣泛用于治療糖尿病，近來不少基礎和臨床觀察研究報告，二者除降低糖尿病血糖之外，尚存在不同程度的腎臟保護作用[9-10]，二者聯合在降血糖方面具有協同效果[11]，但其聯合使用在腎臟保護方面的效果如何少有報道。本研究通過對T2DM小鼠二甲雙胍與沙格列汀聯合干預治療，探究兩藥聯用是否可協同增強T2DM小鼠腎臟保護作用。結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病小鼠尿白蛋白排泄明顯增加，腎小球和腎小管肥大，結構模糊，提示T2DM小鼠在高血糖狀態下，腎臟存在顯著腎小球、腎小管損傷及功能異常。經8周干預治療之后，與格列苯脲組相比，在血糖控制相似的情況下，二甲雙胍組和沙格列汀組糖尿病小鼠尿白蛋白排泄明顯降低，腎臟病理改善更加明顯，證實二甲雙胍和DPP4抑制劑(沙格列汀)干預治療對腎臟具有明確的保護作用。進一步與二甲雙胍和沙格列汀單藥治療組比較，沙格列汀聯合二甲雙胍組UACR顯著降低，腎臟病理改變進一步減輕，提示二者聯合使用對糖尿病小鼠腎臟可發揮協同保護作用。

前期有研究報告顯示[12-13]，二甲雙胍和DPP-4抑制劑(如沙格列汀)可通過改善高血糖狀態下增強的氧化應激發揮腎臟保護作用。本研究顯示：與二甲雙胍和沙格列汀單藥治療組比較，二甲雙胍聯合沙格列汀治療組氧化應激產物(尿8-OHdG和8-iso-PG)顯著降低，抗氧化應激指標(SOD)明顯升高，機體氧化還原狀態明顯改善(GSH/GSSG比值明顯升高)，且在相似降血糖的情況下效果優于二甲雙胍和沙格列汀單藥治療，進一步相關分析顯示糖尿病各組尿白蛋白的降低與尿8-OHdG和8-iso-PG降低、腎組織SOD活性及GSH/GSSG比值升高明顯相關，提示二甲雙胍聯合沙格列汀可協同減輕T2DM小鼠體內增強的氧化應激狀態，改善機體氧化還原平衡紊亂，并與尿白蛋白排泄的降低有關。目前有關二甲雙胍和沙格列汀減輕氧化應激的機制尚不十分清楚，Ommati等[14]發現，二甲雙胍通過上調腎臟GSH水平發揮其抗氧化作用；Zhao等[15]發現，二甲雙胍通過調節AMPK/mTOR信號通路加強其抗氧化能力；Abdel-Aal等[16]研究發現，沙格列汀通過調節腎臟GSH水平改善機體氧化還原平衡；Chen等[17]研究發現，沙格列汀可通過調節AMPK/SIRT1/Nrf2改善細胞氧化應激水平。上述研究提示，二甲雙胍和沙格列汀下調氧化應激的信號轉導通路存在一定的交叉性，這可能與兩者聯合治療協同減輕糖尿病小鼠體內增強的氧化應激狀態，改善機體氧化還原失衡有關。

總之，本研究初步結果顯示，沙格列汀聯合二甲雙胍干預治療對T2DM小鼠腎臟具有協同保護作用，其機制部分可能與提高糖尿病小鼠的抗氧化能力，改善體內氧化還原平衡有關，確切機制有待進一步研究探討。