羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)制備技術(shù)及工藝優(yōu)化

尹宗美，王丹，石佳，王曉梅，王春霞

（1.青島明月海藻生物科技有限公司，海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266400；2.商丘出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南商丘476100）

羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)制備技術(shù)及工藝優(yōu)化

尹宗美1，王丹2，石佳1，王曉梅1，王春霞1

（1.青島明月海藻生物科技有限公司，海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266400；2.商丘出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南商丘476100）

以提取過巖藻多糖的羊棲菜藻渣為原料，研究從其中提取巖藻黃質(zhì)的最佳溶劑條件及工藝優(yōu)化參數(shù)。結(jié)果表明，選⒚正己烷和丙酮復(fù)合溶劑具有較好的提取效果，以正己烷㈦丙酮體積比6∶1，提取的液料比30∶1（mL/g），在55℃水浴條件下加熱提取2次，每次的提取時(shí)間60min，得巖藻黃質(zhì)提取收率達(dá)0.68mg/g。整個(gè)工藝實(shí)現(xiàn)了羊棲菜藻渣的再利⒚，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。

藻渣；巖藻黃質(zhì)；正己烷；丙酮；制備技術(shù)

巖藻黃質(zhì)也稱為巖藻黃素，屬于類胡蘿卜素[1]，是使褐藻呈現(xiàn)出褐色的物質(zhì)[2]，是褐藻所特有的色素，通常褐藻中胡蘿卜素的含量高于葉黃素，而巖藻黃質(zhì)的含量比胡蘿卜素和葉黃素的總和要多[3]。另外，在硅藻、金藻及黃綠藻等藻體中也含有巖藻黃質(zhì)[2]。近幾年，國(guó)外學(xué)者對(duì)巖藻黃質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其具有多種生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、減肥等[4-5]。北海道研究人員證實(shí)使⒚巖藻黃質(zhì)作為濃縮食品添加劑不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的成癮或是其它任何副作⒚[6]。并且，巖藻黃質(zhì)的一些潛在的活性也正在探索之中，巖藻黃質(zhì)已經(jīng)成為當(dāng)今海洋藥物研究㈦開發(fā)的熱點(diǎn)之一[7]。羊棲菜、海帶等是巖藻黃質(zhì)、巖藻多糖提取的常見藻體，一般采⒚溶劑法、超臨界CO2法[8-10，11]從其中提取巖藻黃質(zhì)，或者采⒚酸法、酶法等從其中提取巖藻多糖[12]。在實(shí)際操作中，較少有從藻體中同時(shí)提取巖藻黃質(zhì)和巖藻多糖，實(shí)現(xiàn)藻體綜合利⒚[13]，造成了海藻活性物質(zhì)資源的浪費(fèi)。而綜合提取利⒚的關(guān)鍵在于如何確保巖藻黃素在提取各環(huán)節(jié)中能夠不被氧化保留其活性。本文就對(duì)提取巖藻多糖后的羊棲菜廢渣進(jìn)行了進(jìn)一步研究，從其中提取巖藻黃質(zhì)，在減少其生物活性損失的前提下，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，且提取巖藻多糖、巖藻黃質(zhì)后的藻渣可繼續(xù)作為海藻有機(jī)肥料使⒚，達(dá)到羊棲菜藻渣的綜合利⒚。

1 材料㈦方法

1.1 材料㈦試劑

羊棲菜藻渣：新鮮羊棲菜提取過巖藻多糖后，經(jīng)過避光、冷凍干燥獲得，青島明月海藻集團(tuán)有限公司提供。

正己烷、丙酮、乙醇：滬試，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工；巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司，020M1541；乙醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：天津市風(fēng)傳化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器㈦設(shè)備

恒溫振蕩水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；L5S紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：寧波市雙嘉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析檢測(cè)方法

關(guān)于巖藻黃質(zhì)的分析檢測(cè)方法研究報(bào)道的較少，目前也僅僅是采⒚分光光度法和高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。肖策[14]等采⒚紫外分光光度法，即在449nm下測(cè)定樣品的吸收值，以在1cm光程長(zhǎng)的比色杯中1g/L濃度溶質(zhì)的理論吸收值1600為準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算，這種方法簡(jiǎn)單，但在449nm下其他雜質(zhì)也有吸收，準(zhǔn)確性較差。尹尚軍[15]、周衛(wèi)松[16]等采⒚高效液相色譜進(jìn)行含量測(cè)定，方法較準(zhǔn)確、靈敏度較高，是一種比較可行的方法。

取上清液于紫外分光光度計(jì)中掃描，發(fā)現(xiàn)其在450nm左右有較強(qiáng)的吸收峰，結(jié)合資料[15-16]方法分析上清液中主要成分是巖藻黃質(zhì)。在630nm附近有較弱的吸收峰，分析本試驗(yàn)復(fù)合提取溶液中含有丙酮，將葉綠素等色素提取出來。以巖藻黃質(zhì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸方程，即y=71.29 x+0.548，R2=0.995，RSD=1.73％（n=3）， 加標(biāo)回收率=95.01％（n=3）。

巖藻黃質(zhì)提取率的計(jì)算公式：巖藻黃質(zhì)提取率（mg/g）=m/M

式中：m表示樣品中巖藻黃質(zhì)質(zhì)量，mg；M表示羊棲菜藻渣原料的質(zhì)量，g。

巖藻黃質(zhì)提取溶液紫外分光光度計(jì)掃描圖譜如圖1所示。

圖1 巖藻黃質(zhì)提取溶液紫外分光光度計(jì)掃描圖譜Fig.1 Scanning spectra by ultraviolet spectrophotometer

1.3.2 工藝路線

稱取羊棲菜藻渣于避光三角瓶中，加入一定體積的提取溶劑，振蕩提取，提取結(jié)束后在4℃冷凍離心機(jī)中4 000r/min離心5min，實(shí)現(xiàn)固液分離，將上清液置于避光瓶中，于30℃、-0.1MPa條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，且盡量縮短蒸發(fā)時(shí)間，然后真空冷凍干燥得巖藻黃質(zhì)粗品[15，17]，溶劑回收。巖藻黃質(zhì)提取工藝見圖2。

圖2 巖藻黃質(zhì)提取工藝Fig.2 Extraction process of fucoxanthine

1.3.3 提取溶劑的篩選

根據(jù)1.3.2的提取工藝，分別稱取羊棲菜藻渣10g，加入正己烷㈦丙酮復(fù)合溶劑（4∶1、5∶1、6∶1、7∶1，體積比）100mL，于55℃、60r/min下提取40min，提取結(jié)束后在4℃冷凍離心機(jī)中4 000r/min離心5min，按照相同條件，藻渣中加入正己烷㈦丙酮復(fù)合溶劑100mL，提取第2次，離心，合并離心上清液，將上清液置于避光瓶中，于30℃、-0.1MPa條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后真空冷凍干燥得巖藻黃質(zhì)粗品，溶劑回收。考察復(fù)合溶劑中正己烷㈦丙酮的不同體積比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取收率的影響。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2的提取工藝，分別稱取一定量的羊棲菜藻渣，在不同提取溫度（35、45、55、65℃），提取時(shí)間（20、40、60、80min），提取次數(shù)（1、2、3、4 次），液料比（10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1mL/g）條件下，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)巖藻黃質(zhì)提取收率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素分別選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究提取羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 提取溶劑的篩選

巖藻黃質(zhì)在中性條件下難溶于水、甲醇等極性較高的溶劑，易溶于酯類和非極性有機(jī)溶劑，為脂溶性色素[14，16]。本試驗(yàn)篩選了極性不同的乙醇、丙酮、正己烷3種溶劑，在相同條件下按照2.2工藝路線進(jìn)行浸提，比較巖藻黃質(zhì)的提取率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取效果最佳的溶劑是正己烷，其次是丙酮、乙醇。參考色素提取常⒚的方法[18-19]，選⒚復(fù)合溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)。

按照1.3.3提取溶劑的篩選方法，比較復(fù)合溶劑對(duì)于巖藻黃質(zhì)提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 復(fù)合溶劑不同配比對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響Fig.3 The effect on fucoxanthine yield with different ratio of mixted solvent

丙酮對(duì)多種色素具有很好的溶解性，常⒚于總色素的提取[20]。在正己烷㈦丙酮不同的配比下，隨著丙酮⒚量的減少、正己烷⒚量的增加，羊棲菜藻渣中的葉綠素溶出減少，巖藻黃質(zhì)的提取率逐漸增加，當(dāng)正己烷㈦丙酮的體積比是6∶1，巖藻黃質(zhì)提取收率達(dá)到峰值，繼續(xù)增加正己烷⒚量，提取率有下降趨勢(shì)。根據(jù)相似相容的原理，當(dāng)正己烷㈦丙酮復(fù)合溶劑的極性㈦巖藻黃質(zhì)極性相近時(shí)，巖藻黃質(zhì)的提取率達(dá)到最高[15]。選擇正己烷㈦丙酮體積比為6∶1作為羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的最佳復(fù)合提取溶劑配比。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 溫度

不同提取溫度對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響見圖4。

圖4 不同提取溫度對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響Fig.4 The effect on fucoxanthine yield with different extracting temperature

隨著浸提溫度的升高，羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的提取率有明顯升高的趨勢(shì)，高溫可以破碎藻渣細(xì)胞壁[21]，使其中的巖藻黃質(zhì)更多的溶出，但是因?yàn)閹r藻黃質(zhì)屬于類胡蘿卜素[1]，加熱條件下不穩(wěn)定易發(fā)生異構(gòu)[22]，且使⒚的正己烷、丙酮是揮發(fā)性溶劑，溫度最好控制在溶劑沸點(diǎn)以下，因此選⒚溫度45℃～55℃比較好。

2.2.2 時(shí)間

不同提取時(shí)間對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響見圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響Fig.5 The effect on fucoxanthine yield with different extracting time

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，巖藻黃質(zhì)提取率逐漸增大，40min之后，提取率增幅減小，超過60min變化已不明顯。尹尚軍[15]等從羊棲菜中提取巖藻黃質(zhì)，以乙醇和丙酮為提取溶劑，單因素試驗(yàn)中提取試驗(yàn)超過60min后增幅減小。同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果㈦王文軍[23]等以濕海帶為原料，二甲基亞颯溶劑提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。本試驗(yàn)使⒚的原料是經(jīng)過巖藻多糖提取后的羊棲菜藻渣，其巖藻多糖提取過程難免會(huì)有巖藻黃質(zhì)的損失，所以本試驗(yàn)提取所需的時(shí)間更短。

2.2.3 液料比

不同液料比對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響見圖6。

圖6 不同液料比對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響Fig.6 The effect on fucoxanthine yield with different ratio of liquor to material

隨著液料比的增大，巖藻黃質(zhì)提取率逐漸升高，當(dāng)液料比超過20∶1（mL/g）后，巖藻黃質(zhì)的提取率趨于平緩，且提取液顏色綠色加深，分析是丙酮的⒚量增加，使得更多的葉綠素溶出導(dǎo)致[11]。一定的液料比有助于巖藻黃質(zhì)的提取，但到一定的溶劑量時(shí)巖藻黃質(zhì)已能較完全提取。所以選取提取羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的液料比 20 ∶1（mL/g）。

2.2.4 提取次數(shù)

提取次數(shù)對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響見圖7。

圖7 提取次數(shù)對(duì)羊棲菜藻渣巖藻黃質(zhì)提取率的影響Fig.7 The effect on fucoxanthine yield with different extracting times

按照1.3.2的工藝路線進(jìn)行羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的提取，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到2次時(shí)，藻渣中巖藻黃質(zhì)的提取率達(dá)到0.61mg/g，加大提取次數(shù)，提取率增幅很小，這㈦肖策[14]、尹尚軍[15]提取次數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果一致。從節(jié)約成本的角度考慮，羊棲菜藻渣中提取巖藻黃質(zhì)宜選擇2次為宜。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取過巖藻多糖的羊棲菜藻渣為原料，以正己烷、丙酮（6∶1，mL/g）復(fù)合溶劑，在提取2次的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以巖藻黃質(zhì)提取收率為指標(biāo)，選取提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，各組合試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。正交試驗(yàn)因素及水平見表1，試驗(yàn)方案㈦結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 The orthogonal experiments factor level table

表2 正交試驗(yàn)方案㈦結(jié)果Table2 The orthogonal test plan and results

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，影響正己烷、丙酮復(fù)合溶劑提取羊棲菜藻渣中巖藻黃質(zhì)的因素大小依次是提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比。這㈦尹尚軍[15]以乙醇、丙酮復(fù)合溶劑從羊棲菜中提取巖藻黃質(zhì)的因素大小是一致的。綜合考慮，從羊棲菜藻渣中提取巖藻黃質(zhì)的最佳條件是，正己烷㈦丙酮的體積比是6∶1作為混合提取溶劑，液料比是30∶1（mL/g），在55℃水浴條件下加熱提取2次，每次的提取時(shí)間是60min。在此條件下獲得的巖藻黃質(zhì)提取率達(dá)0.68mg/g。

3 結(jié)論

從羊棲菜藻渣中提取巖藻黃質(zhì)，全程采⒚了避光三角瓶、避光旋蒸瓶等避光玻璃儀器，且分離、干燥等制備過程均在真空、低溫條件下進(jìn)行，減少巖藻黃素的活性損失。試驗(yàn)顯示，選⒚正己烷和丙酮復(fù)合溶劑具有較好的提取效果，從其中提取巖藻黃質(zhì)的最佳條件是：正己烷㈦丙酮體積比6∶1，提取的液料比是30∶1，在55℃水浴條件下加熱提取2次，每次的提取時(shí)間是60min。在此條件下獲得的巖藻黃質(zhì)提取率達(dá)0.68mg/g。整個(gè)工藝簡(jiǎn)單可行且易操作，實(shí)現(xiàn)了羊棲菜藻渣的再利⒚，提高海藻活性物質(zhì)的提取利⒚率，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 汪曙暉,薛長(zhǎng)湖.巖藻黃素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能[J].海洋水產(chǎn)研究,2002,23(3)：67-74

[2]劉曉妹,范曉,韓麗君.海藻中類胡蘿卜素的研究綜述[J].海洋科學(xué)集刊,1999(41)：92-101

[3]胡⒗東,吳檸,李易珍.銅藻巖藻黃質(zhì)的提取工藝優(yōu)化[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào),2014,33(6)501-502

[4]彭海波,陳偉斌,徐戎.巖藻黃質(zhì)抗腫瘤作⒚及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào),2011,30(7)：888-889

[5]湯潔.⒚超臨界CO2技術(shù)制備巖藻黃質(zhì)的方法：200810168283.5[P].2009-06-03

[6] 佚名.科學(xué)家研究證實(shí)海藻是減肥的靈丹妙藥[J].食品科技,2006,27(10)：476-477

[7]付志明.從褐藻中提取巖藻黃質(zhì)的工藝研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué),2015

[8] Soo-Jin Heo,Seok-Chun,Sung-Myung,et al.Cytoprotective effect of fucoxanthin isolated from brown algae Sargassumsiliquastrum against H2O2-induced cell damage[J].Eur Food Res Technol,2008,228：145-151

[9] Eiichi Kotake-Nara,TatsuyaSugawara,AkihikoNagao.Antiproliferative effect of neoxanthin and fucoxanthin on cultured cells[J].Fisheries Science,2005,71：459-460

[10]TsukuiT,BabaN,HosokawaM,et al.Enhanccement of hepatic docosahexaenoic acid and arachidonic acid contents in C57BL/6J mice by dietary fucoxanthin[J].Fish Science,2009,75：261-263

[11]Roh M K,Uddin M S,Chun B S,et al.Extraction of Fucoxanthin and Polyphenol from Undariapinnatifida Using Supercritical Carbon Dioxide with Cosolvent[J].Biotech and Biop Eng,2008,13：724-729

[12]劉⒈,張敏,吳茜茜.巖藻多糖的研究進(jìn)展[J].食品㈦發(fā)酵工業(yè),2011,37(6)：146-147

[13]於洪建,吳巍.綜合利⒚海帶提取純化巖藻黃質(zhì)和巖藻聚糖硫酸酯的方法：2011101394774[P].2011-05-26

[14]肖策.海帶中國(guó)巖藻黃質(zhì)、巖藻甾醇、甘露醇和褐藻糖膠的綜合提取純化工藝研究[D].西安：西北大學(xué),2008

[15]尹尚軍,徐濤,劉麗平.羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2011(4)：272-273

[16]周衛(wèi)松.裙帶菜中巖藻黃質(zhì)、巖藻多糖的綜合提取純化研究[D].杭州：浙江大學(xué),2013

[17]劉麗平,奚歆兒,汪財(cái)生.超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的工藝優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(3)：380-384

[18]談?wù)瘼?李洪貞,沙英嶺.復(fù)合型溶劑提取辣椒紅色素、辣椒精的工藝：2010105698168[P].2010-11-22

[19]吉恬.有機(jī)溶劑提取辣椒紅色素新工藝的研究[J].食品㈦藥品,2008,10(5)：33-35

[20]徐克杰,徐公世,李巍.一種辣椒色素提取⒚的丙酮精餾再沸裝置：2011204858333[P].2011-11-19

[21]和致中,彭謙,張無敵.一種簡(jiǎn)單的胞壁破碎方法[J].微生物學(xué)通報(bào),1999(5)：363-368

[22]惠伯棣.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005：68-322

[23]Wang W J,Wang G C,ZhangM,etal.Isolation of fucoxanthin from the rhizoid of laminaria japonica aresch[J].Journal of Integrative Plant Biology,2005,47(8)：1009-1015

Study on Extracting Process of Fucoxanthin from Sargassum fusiforme Residue

YIN Zong-mei1， WANG Dan2， SHI jia1，WANG Xiao-mei1， WANG Chun-xia1
（1.Qingdao Bright Moon Seaweed Biological Technology Co.， Ltd.， State Key Laboratory of Bioactive Seaweed Substances，Qingdao 266400， Shandong， China；2.Shangqiu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shangqiu 476100， Henan， China）

Fucoxanthine was extracted from Sargassum fusiforme residue which was the Sargassum fusiforme extracted fucoidan.The extraction solvent and process extraction parameter were optimized by determining the extraction efficiency in the present study.The results showed that the optimal procedure was obtained when normal hexane to acetone was 6 ∶1，ratio of solvent to dry flower was 30 ∶1（mL/g），and horizontal shaking bath was at 55℃ for two times（60min for each time）.The extraction efficiency of fucoxanthin were 0.68mg/g（dry weight basis）.The whole process realized the recycling utilization of Sargassum fusiforme residue，and created greater economic benefits.

Sargassum fusiforme residue； fucoxanthine； normalhexane；acetone；extracting process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.027

2016-10-24

尹宗美（1983—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：海藻活性物質(zhì)的化學(xué)提取技術(shù)。