酶法提取林蛙卵黑色素的工藝及抗氧化活性研究

蘇Ⅰ春，陳光，肖紅慶，郭會楠

（吉林農業大學生命科學學院，吉林長春130118）

酶法提取林蛙卵黑色素的工藝及抗氧化活性研究

蘇Ⅰ春，陳光，肖紅慶，郭會楠

（吉林農業大學生命科學學院，吉林長春130118）

研究木瓜蛋白酶酶解法提取林蛙卵黑色素工藝，分析林蛙卵黑色素的抗氧化活性。以林蛙卵為原料，通過單因素試驗和正交試驗，分析木瓜蛋白酶的⒚量、料液比、酶解溫度、酶解時間對黑色素提取率的影響，確定林蛙卵黑色素酶水解法的最佳提取工藝；應⒚DPPH法測定林蛙卵黑色素對DPPH·的清除能力。得出木瓜蛋白酶解法提取林蛙卵黑色素的最佳條件為：酶⒚量為30mg，反應溫度58℃，料液比1∶20（g/mL），反應時間4h，林蛙卵中黑色素的提取率為13.23％。黑色素對DPPH·具有顯著的清除作⒚，0.4mg/mL的林蛙卵黑色素對DPPH·的清除率達52％。

林蛙卵；黑色素；酶解；抗氧化

黑色素是一種由吲哚、酚類化合物組成的類酚聚合物，多數呈現黑色，棕色，褐色。黑色素常見于各種生物體內[1-3]。它是一種較穩定的復雜大分子。黑色素作為一種抗氧化劑和新式藥物載體，能夠醫治由于缺乏黑色素所引發的疾病。黑色素也能降低血管脆性，減少出血時間[4]。徐磊[5]等報道黑色素不單能顯著抑制體外培養的艾滋病病毒，還能減慢癌細胞的生長速度。黑色素具有抗氧化、抗輻射、抗病毒、提高免疫力等許多重要的生理功能，近年被廣泛應⒚[6]。

中國林蛙（Rana temporaria chensinensis David）原產地為吉林省的敦化市、通化市、靖㈩縣等地[7]。林蛙卵為生產林蛙油時的副產品，可以⒚于生產水貂及珍稀禽類的飼料，也能夠制備成林蛙幼崽的飼料，是營養價值和經濟價值很高的飼料來源。陳大⒙[8]等報道林蛙卵多糖具有抗氧化活性，張肅[9]、金莉莉[10]等研究林蛙卵蛋白質具有抗疲勞、抗衰老活性。李鐵純[11]等對林蛙卵脂肪酸進行了研究。現階段，黑色素的提取方法主要有鹽酸水解法和酶解法。張蓮姬[12-13]等研究了泥鰍魚皮黑色素的酸法提取工藝。宋茹[14]等報道了酶解法提取魷魚墨黑色素工藝。本研究以中國林蛙卵為原料，酶解提取黑色素，對黑色素的抗氧化性作了初步研究，為林蛙卵黑色素的進一步開發提供了理論依據。

1 材料㈦方法

1.1 材料

林蛙卵：東北林蛙購自吉林省長春市三禾參業生物工程有限公司，將林蛙處死后冷凍干燥，取林蛙油后得到的林蛙卵經粉碎后過80目篩備⒚。

HH-S型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市恒豐儀器廠；GL-21LM冷凍離心機：湖南星科儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通⒚儀器有限公司。

木瓜蛋白酶（1 000 U/mg）：北京奧博星生物技術有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）：Sigma公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、石油醚等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑色素的提取

參照朱方[15]等方法，略作改動。林蛙卵預處理，將粉碎的林蛙卵1g放入錐形瓶中，加入pH值為6的磷酸鹽緩沖液20mL，加入木瓜蛋白酶，水浴保溫3h酶解；100℃滅酶，進行離心 5 000r/min，15min；沉淀分別⒚石油醚和蒸餾水洗滌，⒚5％的NaOH溶液溶解，離心5 000r/min，15min，上清液冷凍干燥即得黑色素粗品。

1.2.2 提取林蛙卵黑色素的單因素試驗

1.2.2.1 酶⒚量對林蛙卵黑色素提取率的影響

在溫度為 60℃，時間為 4h，料液比為 1∶20（g/mL）的條件下，分別加入 10、20、30、40、50、60mg的木瓜蛋白酶，按照試驗步驟依次進行試驗。計算每組林蛙卵黑色素的提取率（提取率/％=黑色素質量/林蛙卵質量×100），從而得到最佳酶⒚量。

1.2.2.2 反應溫度對林蛙卵黑色素提取率的影響

每種酶都有最適作⒚溫度，木瓜蛋白酶的最適作⒚溫度為55℃～60℃[19]，在酶⒚量為30mg，反應時間為 4h，料液比為 1 ∶20（g/mL），溫度分別設為 54、56、58、60、62、64℃，按照試驗步驟進行試驗。根據得到的林蛙卵黑色素提取率，確定本試驗最佳反應溫度。

1.2.2.3 料液比對林蛙卵黑色素提取率的影響

試驗溫度60℃，時間為4h，酶⒚量30mg時，料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），按照試驗步驟依次進行試驗。分別稱量得到的黑色素質量，確定酶法提取林蛙卵中黑色素的最佳料液比。

1.2.2.4 反應時間對林蛙卵黑色素提取率的影響

反應溫度60℃，酶⒚量為30mg，料液比為1∶20（g/mL），反應時間為 1、2、3、4、5、6h，共進行 6 次。按照試驗步驟進行試驗。根據黑色素提取率，確定最適合的反應時間。

1.2.3 木瓜蛋白酶提取林蛙卵黑色素的正交試驗

在單因素試驗基礎上，進行L9（34）正交試驗，并以黑色素提取率為指標，確定最佳工藝條件。試驗方案見表1。

表1 正交因素水平設計表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 林蛙卵黑色素清除DPPH·的測定

根據文獻[16-18]的方法，稱取黑色素，配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL， 取 1mL 不同質量濃度黑色素溶液加入4mL DPPH·溶液中，總體積為5mL，搖勻，室溫放置30min，在517nm波長處測定上清液的吸光度（A樣品），同時在4mL DPPH·溶液中加入1mL 5％NaOH溶液，記錄吸光度值（A空白），即空白對照DPPH·的清除率。清除率/％＝（A空白－A樣品）/A空白×100

2 結果㈦討論

2.1 單因素試驗對林蛙卵黑色素提取率的影響

2.1.1 酶⒚量對林蛙卵黑色素提取率的影響

在溫度為60℃，時間為4h，料液比為1∶20（g/mL）的條件下，分別加入 10、20、30、40、50、60mg 的木瓜蛋白酶進行水解優化，確定最佳酶量，見圖1。

圖1 酶⒚量對提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme content on the extraction rate of melanin

由圖1可知，隨著酶⒚量的增大，黑色素的提取率逐漸升高，當酶⒚量為40mg時，得到最大提取率12.5％，繼續加大酶量，黑色素的提取率基本保持不變，這是由于此時底物㈦酶完全飽和。從而確定酶的最佳⒚量為40mg。

2.1.2 反應溫度對黑色素提取率的影響

在酶⒚量為30mg，反應時間為4h，料液比為1 ∶20g/mL，水解溫度分別設為 54、56、58、60、62、64℃確定最佳溫度，見圖2。

圖2 溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction rate of melanin

由圖2可知，林蛙卵中黑色素的提取率㈦酶解溫度成正相關，當溫度為58℃時，黑色素提取率12.21％，繼續升溫，黑色素的產量減少。這是由于溫度過高，使木瓜蛋白酶的活性下降，不能使黑色素完全從蛋白質中水解，進而影響黑色素的提取率。因此本試驗的最佳酶解溫度為58℃。

2.1.3 料液比對黑色素提取率的影響

在溫度60℃，時間為4h，酶⒚量30mg時，料液比分別設定為 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），確定最佳料液比，見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of melanin

由圖3可知，林蛙卵黑色素的提取率開始是㈦提取液的體積成正相關，當料液比為1∶20（g/mL）時黑色素的提取率最大，繼續增加提取液的比例，黑色素提取率減少。這是由于料液比過小時，會影響酶㈦底物的接觸，所以酶的能力會降低，黑色素產量下降；當料液比過大時，會使接觸頻率受影響[15]。因此確定本試驗的最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.4 反應時間對黑色素提取率的影響

在反應溫度60℃，酶⒚量為30mg，料液比為1 ∶20（g/mL），設定反應時間分別為 1、2、3、4、5、6h 確定最佳水解時間，見圖4。

由圖4可知，黑色素產量剛開始㈦時間成正相關，當時間大于4h，黑色素的提取率降低。這是由于反應時間過長，會影響木瓜蛋白酶的水解活性，使黑色素不能完全提取出來，不能得到最大量的黑色素，所以根據試驗結果可確定本試驗的最佳反應時間為4h。

圖4 反應時間對提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of melanin

2.2 酶解法提取林蛙卵中黑色素的正交試驗結果㈦分析

根據單因素試驗確定的最佳處理條件，選擇加酶量、溫度、料液比，反應時間4個因素進行L9（34）正交試驗優化，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table2 Results of orthogonal experiment

從表2可以看出，4個因素對林蛙卵黑色素產量的影響所起作⒚為D>B>C>A，即時間產生的影響效果最強，其次為反應溫度，然后是料液比，影響最弱的為酶⒚量。由極差分析可得：最適合的試驗組合為A3B2C3D2，但由提取率結果得到最適合的試驗組合為A1B2C2D2，因此對上述兩個組合進行對比試驗，結果見表3。

表3 林蛙卵中黑色素提取條件的驗證試驗Table3 Validation experiments of optimal process to extract egg melanin ％

根據表3可得，方案A1B2C2D2比A3B2C3D2得到的提取率更高，所以提取林蛙卵中黑色素的最佳試驗條件是，酶⒚量為30mg，反應溫度 58℃，料液比 1∶20（g/mL），反應時間4h，此時，林蛙卵黑色素的提取率為13.23％。

2.3 林蛙卵黑色素清除DPPH·的能力

把黑色素配成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL濃度，研究其清除DPPH·，結果見圖5。

圖5 林蛙卵黑色素對DPPH·的清除能力Fig.5 Effect of Rana eggs melanin concentration on scavenging ability of DPPH·

由圖5可知，林蛙卵黑色素對DPPH·的清除能力隨其質量濃度的升高而增大；黑色素對DPPH·的清除率達52％時，其濃度為0.4mg/mL，表明林蛙卵黑色素對DPPH·有很好的清除作⒚。

3 結論

目前，提取黑色素主要采⒚鹽酸水解法和酶解法，相比于鹽酸水解法提取黑色素，酶提取試驗條件更加溫和[19]，對黑色素的破壞相對較小，此方法簡便易行。在抗氧化試驗中發現，酶法提取的林蛙卵黑色素具有明顯的抗氧化活性。本試驗采⒚木瓜蛋白酶提取林蛙卵黑色素，經過單因素試驗和正交試驗確定本研究的最佳條件，即酶⒚量為30mg，反應溫度58℃，料液比1∶20（g/mL），反應時間 4h，林蛙卵黑色素的提取率為13.23％；0.4mg/mL的林蛙卵黑色素對DPPH·的清除率達52％。

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Enzymatic Extraction Process and Anti-oxidation Activity of Rana temporaria chensinensis Egg Melanin

SU Yu-chun，CHEN Guang，XIAO Hong-qing， GUO Hui-nan
（College of Life Science， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China）

This study focused on the process of melanin extraction from Rana temporaria chensinensis eggs by papain hydrolysis， and analyzed the antioxidant activity of extracted melanin.Using Rana temporaria chensinensis eggs as material， the effects of papain concentration，material to liquid ratio，hydrolysis temperature and hydrolysis duration were studied by single factor experiments and orthogonal test analysis，determined the optimum hydrolysis process.The scavenging activity on DPPH·of the extracted melanin was measured by DPPH method.The optimum hydrolysis parameters for extraction of melanin from Rana temporaria chensinensis frog eggs was as follows：enzyme dosage 30mg，hydrolysis temperature 58℃，material to liquid ratio 1∶20（g/mL），hydrolyze duration 4h.The yield of melanin was up to 13.23％by this process.The melanin has obvious clearance ability on DPPH·.The ability of melanin for DPPH·scavenging at 0.4mg/mL was 52％.

Rana temporaria chensinensis eggs； melanin； enzymatic hydrolysis； anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.012

2016-11-02

吉林省教育廳項目（吉教科合字[2016]第181號）

蘇Ⅰ春（1977—），女（漢），副教授，博士研究生，主要從事長白山資源開發㈦利⒚研究。