QuEChERS/超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法同時測定小麥粉中17種農藥殘留

劉永強,劉 勝,許文娟,李 凱,張 靖,孫 軍

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局 技術中心,山東 濰坊 261041；2.淄博出入境檢驗檢疫局 技術中心,山東 淄博 255035)

QuEChERS/超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法同時測定小麥粉中17種農藥殘留

劉永強1*,劉 勝2,許文娟1,李 凱1,張 靖1,孫 軍1

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局 技術中心,山東 濰坊 261041；2.淄博出入境檢驗檢疫局 技術中心,山東 淄博 255035)

建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)同時測定小麥粉中17種農藥殘留的檢測方法。樣品采用QuEChERS方法進行前處理,以0.1%(體積分數)乙酸乙腈溶液提取,PSA和C18吸附劑凈化,電噴霧正離子模式檢測,外標法定量,同時建立了包含一級精確質量和二級碎片離子信息的篩查確證譜庫。在各自的線性范圍內,17種化合物的線性關系良好,相關系數均大于0.995。方法的定量下限為5.0～10.0 μg/kg,3個加標水平下的回收率為70.3%～114.9%,相對標準偏差(RSD,n=6)為0.4%～11.7%。該方法操作簡便、穩定性好,具有較強的實際應用價值。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜；農藥殘留；小麥粉；QuEChERS

現代農業中農藥的廣泛使用導致其殘留問題日趨顯現,對國民健康和生態環境造成了巨大影響,因此各國政府和相關國際組織對農藥殘留極為重視。例如中國在《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)[1]中規定了433種農藥4140項最大殘留限量；歐盟、美國、日本等地區和國家也制訂了各類食品中多種農藥的最大殘留限量。為了保證國內和出口農產品的安全,需建立農藥多殘留的快速篩查方法。

目前小麥粉中農藥多殘留的檢測方法主要包括氣相色譜法(GC)[2]、液相色譜法(LC)[3-4]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[5]和液相色譜-串聯四極桿質譜法(LC-MS/MS)[6-7]。其中GC和LC的定性能力較弱,而GC-MS和LC-MS/MS則均為低分辨質譜。近年來,高分辨質譜以其高質量精度、高分辨率和高通量分析的優勢[8-9]在農藥多殘留篩查檢測中的應用逐漸增多[10-13],龐國芳院士等在此領域做了較多研究[14-17],但利用高分辨質譜進行糧谷中農藥多殘留篩查檢測的研究鮮有報道。

本文基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術,采用QuEChERS前處理技術,通過優化實驗條件和儀器參數,建立了小麥粉中17種農藥殘留的篩查分析方法,同時建立了包含保留時間、精確質量數和4個碰撞能量(10、20、30、40 eV)下碎片離子質譜圖信息的篩查譜庫。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290-6530超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀(安捷倫科技公司,美國)；5810R高速冷凍離心機(Eppendorf公司,德國)；R-210旋轉蒸發儀(Buchi公司,瑞士)；T25均質器和MS3渦流混勻器(IKA公司,德國)；XS203S電子天平(Metler Toledo公司,瑞士)；Reference A10超純水機(Millipore公司,美國)。

17種農藥標準品(純度:95.1%～99.7%,Dr.Ehrenstorfer公司,德國)；乙腈(色譜純,Fisher公司,美國)、甲醇(色譜純,Merck公司,美國)；無水乙酸鈉(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司)；吸附劑PSA(N-丙基乙二胺)、C18(十八烷基鍵合硅膠)(天津博納艾杰爾公司)。

1.2 樣品提取與凈化

提取:稱取小麥粉樣品3 g(精確至0.01 g),置于100 mL塑料離心管中,加入1.5 g無水乙酸鈉,15 mL 0.1%(體積分數)乙酸乙腈溶液,11 000 r/min均質提取2 min,以10 000 r/min離心10 min,移取上層提取液10 mL(相當于2.0 g樣品)于250 mL尖底旋蒸瓶中,40 ℃水浴旋轉濃縮至近干,用乙腈渦混溶解殘渣并定容至2.0 mL,待凈化。

凈化:分別稱取150 mg C18、150 mg PSA置于10 mL塑料離心管中,將上述2 mL溶解液轉入該離心管,渦混2 min,5 000 r/min離心3 min,取1 mL上清液于玻璃離心管中,用氮氣吹干,0.1%甲酸水-乙腈(9∶1,體積比)定容至1 mL,過0.45 μm濾膜,供分析。

1.3 儀器條件

液相色譜條件:色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(3.0 mm×100 mm,2.7 μm)。流動相:A為0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨),B為乙腈。梯度洗脫程序:0～5.00 min,1%～40%B；5.00～8.00 min,40%B；8.00～14.00 min,40%～60%B；14.00～18.00 min,60%～90%B；18.00～18.01 min,90%～1%B；18.01～20.50 min,1%B。流速:0.4 mL/min；柱溫:40 ℃；進樣量:10 μL。

質譜條件:離子源:ESI。掃描方式:正離子掃描。掃描范圍:m/z100～1 000。干燥氣溫度:325 ℃；干燥氣流速:10 L/min；霧化器壓力:276 kPa；鞘氣溫度:350 ℃；鞘氣流速:12 L/min；噴嘴電壓:0 V；參比離子為m/z121.050 9，922.009 8,用于實時校正；Targeted MS/MS模式下采集二級質譜數據,在Targeted List Table中設置以下參數:母離子、母離子的電荷狀態(Z,1)、保留時間、保留時間偏差(0.5 min)、四極桿分辨率[Isolation Width,Narrow(～1.3m/z)]和碰撞能量。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優化

2.1.1 提取條件的優化 考察了農殘檢測中常用試劑乙酸乙酯、丙酮、乙腈和0.1%乙酸乙腈的提取效果,4種提取液均為澄清狀態,無明顯差別。從實驗結果看,乙酸乙酯、丙酮、乙腈和0.1%乙酸乙腈對17種目標物的平均回收率分別為43.2%、51.7%、64.3%和81.5%,以0.1%乙酸乙腈的提取效率最高。在此基礎上考察了不同體積提取試劑(5、10、15、20、25 mL)的影響,結果發現,當提取試劑的體積小于15 mL時,目標物的平均回收率隨提取試劑體積的增加而提高,提取試劑的體積大于15 mL時,回收率無明顯提高。考慮到提取試劑體積越大,樣品中的干擾物被提取出的幾率越大,所以選用提取試劑0.1%乙酸乙腈的體積為15 mL。

目前農殘檢測中多采用均質提取方式,相比于其它方式,均質提取可以有效破壞樣品組織細胞,保證提取試劑和樣品的充分接觸,且在高速均質過程中釋放出較多熱量也有利于農藥殘留的提取,因此本實驗選擇均質提取。

采用QuEChERS前處理方法檢測干性植物源性樣品的農藥殘留時,檢測前樣品需加入適量的水浸泡[18]。本實驗對比了未加水浸泡提取和加水浸泡提取兩種方式對回收率的影響。結果表明,除噻蟲嗪、甲萘威和咪鮮胺外,未加水浸泡提取目標物的回收率高于加水浸泡提取,且加水浸泡后的小麥粉極易結塊粘結在均質機刀頭上,難以操作。因此本實驗選擇未加水浸泡提取方式。

2.1.2 凈化條件的優化 對于植物源性樣品,常用的凈化吸附劑有PSA、C18和GCB,PSA對各種有機酸、色素和部分糖和脂肪的去除比較有效；C18主要用于去除非極性雜質；GCB是去除色素的首選,但其對部分農藥的吸附較強。考慮到小麥粉樣品中色素較少,選用了PSA和C18兩種吸附劑進行優化,固定PSA和C18用量均為200 mg,比較兩種吸附劑單獨使用和混合使用的實驗效果。結果表明,PSA和C18單獨使用時17種目標物的平均回收率分別為60.3%和72.7%,兩者混合使用時回收率為83.2%。當PSA和C18分別為100、150、200、300 mg時,考察了兩兩組合時17種目標化合物的回收率,結果表明,當PSA和C18均為150 mg時,凈化效果最好,94.1%的目標化合物回收率為70%～120%。因此最終確定PSA和C18兩種吸附劑的用量均為150 mg。

2.2 儀器參數的優化

離子源參數的設置會直接影響質譜儀器分析的靈敏度和穩定性,對于實驗所用的ESI源而言,鞘氣溫度、鞘氣流速和噴嘴電壓3個參數對目標化合物測定有較大影響。分別設定噴嘴電壓為0、125、250、500 V,以17種目標物的峰面積來衡量色譜峰的信號強度,結果表明,17種目標物均在噴嘴電壓為0時響應值最高。分別將鞘氣溫度和鞘氣流速設定為300、325、350 ℃和10、11、12 L/min,兩兩組合,結果表明,除甲硫威外,其余化合物均在鞘氣溫度和鞘氣流速為350 ℃和12 L/min時響應值較高。綜上,鞘氣溫度、鞘氣流速和噴嘴電壓分別設定為350 ℃、12 L/min和0 V。

2.3 譜庫的建立

建立篩查譜庫分為兩步:首先,在全掃描模式(MS mode)下對17種農藥的混標進行測定,各目標物的提取離子色譜圖見圖1；第二步,在目標MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下進行采集,得到不同碰撞能量下碎片離子的質譜圖。表1列出了17種農藥的分子式、理論分子量、保留時間、母離子、CAS號和碰撞能量為20 eV時相對豐度最高的2個質譜碎片離子等信息。

表1 17種農藥的分子式、理論分子量、保留時間、母離子、CAS號及碎片離子信息

(續表1)

No．PesticidecompoundMolecularformulaTheoreticalmassRetentiontime(min)Precursor(m/z)CASnumberFragmentationions(m/z)10Imidacloprid(吡蟲啉)C9H10ClN5O2255 05435 196256 0597105827-78-9175 0928，209 059511Acetamiprid(啶蟲脒)C10H11ClN4222 06865 547223 0745135410-20-7126 0105，56 049412Phosphamidon(磷胺)C10H19ClNO5P299 07076 293300 076513171-21-6127 0154，174 067813Carbofuran(克百威)C12H15NO3221 10657 373222 11251563-66-2123 0433，165 091414Carbaryl(甲萘威)C12H11NO2201 08027 852202 086363-25-2145 0647，127 054215Metalaxyl(甲霜靈)C15H21NO4279 14868 486280 154457837-19-1192 1382，160 112016Methiocarb(甲硫威)C11H15NO2S225 083910 958226 08912032-65-7122 0689，166 064117Prochloraz(咪鮮胺)C15H16Cl3N3O2375 032714 610376 038367747-09-5308 0010，309 9981

圖1 17種農藥的提取離子色譜圖

Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 17 pesticides

2.4 定性篩查及確證

應用建立的譜庫進行檢索時,化合物的精確質量數偏差、保留時間偏差、同位素分布和同位素豐度比是影響定性判定的主要因素,將通過定性篩查出的疑似陽性化合物在目標MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下進行確證。根據歐盟SANTE/11945/2015[19],使用高分辨質譜確證時,至少需1個精確質量數的母離子和1個碎片離子。因此,應用本文建立的譜庫,17種目標化合物均能被準確確證。以甲萘威為例,列出了定性確證的譜圖信息,見圖2。

2.5 方法學考察

取空白小麥粉樣品,按“1.2”方法處理后,得到空白樣品提取液,用其稀釋混標溶液配制成系列基質標準溶液,在建立的儀器條件下測定,以峰面積(Y)對質量濃度(X)作標準曲線,以10倍信噪比(S/N=10)計算定量下限(LOQ)。在測定不含待測目標物的小麥粉樣品中進行3個加標水平(LOQ、2LOQ和5LOQ)的回收率和精密度實驗,每個加標水平做6個平行。17種目標化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(r)、LOQ、回收率及相對標準偏差(RSD)見表2。17種目標化合物在線性范圍內相關系數均大于0.995,LOQ為5.0～10.0 μg/kg,3個加標水平下的回收率為70.3%～114.9%,RSD不大于11.7%,方法精密度好,回收率高,能夠滿足日常檢測的需求。

圖2 小麥粉中甲萘威的定性確證信息

表2 17種農藥的線性范圍、線性方程、相關系數(r)、定量下限(LOQ)、回收率和相對標準偏差(n=6)

number(1-17) denoted was the same as that in Table 1

2.6 實際樣品檢測

利用本實驗建立的方法對市場上購買的20份小麥粉樣品進行檢測,測出陰性樣品8份,陽性樣品12份,其中5份檢出吡蟲啉,3份檢出啶蟲脒,2份檢出克百威和啶蟲脒,1份檢出多菌靈和吡蟲啉,1份檢出吡蟲啉和啶蟲脒。所檢出的吡蟲啉含量為0.007～0.021 mg/kg,啶蟲脒含量為0.011～0.092 mg/kg,克百威含量分別為0.031 mg/kg和0.052 mg/kg,多菌靈含量為0.019 mg/kg,均未超出GB 2763-2014[20]所規定的最大殘留限量。

3 結 論

本研究建立了適用于小麥粉中17種農藥殘留的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜篩查確證方法。該方法高效簡便,回收率、重現性和檢出限等指標完全滿足日常檢測的要求,可同時對樣品中的目標物進行篩查和確證,為快速檢測小麥粉中的農藥殘留提供了科學參考。

[1] GB 2763-2016.National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People’s Repubic of China(食品安全國家標準-食品中農藥最大殘留限量.中華人民共和國國家標準).

[2] Gao D,Chen S H,Zhang Q,Yang Y T.J.FoodSaf.Qual.(高丁,陳士恒,章晴,楊永壇.食品安全質量檢測學報),2015,6(4):1116-1121.

[3] Aqai P,Peters J,Gerssen A,Haasnoot W,Nielen M W F.Anal.Bioanal.Chem.,2011,400:3085-3096.

[4] Zhang J H,Ouyang L,Peng X K,Xia L X,Li H,Wang H.J.Instrum.Anal.(章建輝,歐陽麗,彭新凱,夏立新,李歡,汪輝.分析測試學報),2015,34(12):1430-1433.

[5] Wu C M,Cheng X M,Li L,Huang Z B,Liang Z G.Chin.J.Trop.Agric.(吳春梅,程雪梅,李亮,黃志波,梁志剛.熱帶農業科學),2012,32(11):90-96.

[6] Ruan S S,Liu G H,Liu S C,Zhu Z,Liu J J.J.Instrum.Anal.(阮莎莎,劉桂華,劉素純,朱舟,劉建軍.分析測試學報),2016,35(4):420-425.

[7] Shen Y,Liu X J,Xu D M,Sun X.Agrochemicals(沈燕,劉賢進,徐敦明,孫星.農藥),2011,50(11):831-833.

[8] Li X J,Peng T,Li C J.J.Instrum.Anal.(李曉娟,彭濤,李重九.分析測試學報),2012,31(5):628-632.

[9] Krauss M,Singer H,Hollender J.Anal.Bioanal.Chem.,2010,397:943-951.

[10] Sun B X,Guo D H,Ding Z P,Ji F,Dong J C,Yao J T.J.Instrum.Anal.(孫碧霞,郭德華,丁卓平,冀峰,董吉川,姚勁挺.分析測試學報),2010,29(10):1017-1024.

[11] Zhao M Y,Han F,Sun J W,Song W,Lü Y N,Hu Y Y,Zheng P,Sheng X,Deng X J.J.Instrum.Anal.(趙慕雨,韓芳,孫錦文,宋偉,呂亞寧,胡艷云,鄭平,盛旋,鄧曉軍.分析測試學報),2016,35(12):1513-1520.

[12] Hou R Y,Bian H Z,Zhao X X,Hu Y F,Su T,Wang X H,Wan X C.J.Instrum.Anal.(侯如燕,卞紅正,趙秀霞,胡祎芳,蘇婷,王孝輝,宛曉春.分析測試學報),2011,30(1):58-63.

[13] Si X X,Zhu R Z,Liu Z H,Ma X Y,Zhu L,Zhang F M,Liu C B,Lu S M.J.Instrum.Anal.(司曉喜,朱瑞芝,劉志華,馬雪英,朱麗,張鳳梅,劉春波,陸舍銘.分析測試學報),2016,35(5):532-538.

[14] Zhao Z Y,Shi Z H,Kang J,Peng X,Cao X Y,Fan C L,Pang G F,Lü M L.Chin.J.Chromatogr.(趙志遠,石志紅,康健,彭興,曹新悅,范春林,龐國芳,呂美玲.色譜),2013,31(4):372-379.

[15] Li X Y,Zhang H Y,Chang Q Y,Fan C L,Pang G F,Cao Z,Wang W W.Chin.J.Chromatogr.(李曉穎,張紅醫,常巧英,范春林,龐國芳,曹喆,王雯雯.色譜),2014,32(3):268-277.

[16] Wang H J,Xue Y W,Kang J,Peng X,Chang Q Y,Fan C L,Pang G F.Chin.J.Anal.Lab.(王慧君,薛亞薇,康健,彭興,常巧英,范春林,龐國芳.分析試驗室),2015,34(4):383-387.

[17] Li C M,Hu X Y,Fan C L,Zhang B L,Peng T,Chang Q Y,Pang G F,Wang W W.J.Instrum.Anal.(李春苗,胡雪艷,范春林,張博倫,彭濤,常巧英,龐國芳,王雯雯.分析測試學報),2017,36(4):431-448.

[18] Yu L,Song W,Lü Y N,Zhao M Y,Zhou F F,Hu Y Y,Zheng P.Chin.J.Chromatogr.(余璐,宋偉,呂亞寧,趙暮雨,周芳芳,胡艷云,鄭平.色譜),2015,33(6):597-612.

[19] SANTE/11945/2015.Guidance Document on Analytical Quality Control and Method Validation Procedures for Pesticides Residues Analysis in Food and Feed. European Commission Directorate-General for Health and Food Safety(食品及飼料品農藥殘留分析質量控制和驗證程序指導文件.歐盟健康和食品安全總司).

[20] GB 2763-2014.National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People’s Repubic of China(食品安全國家標準-食品中農藥最大殘留限量.中華人民共和國國家標準).

Simultaneous Determination of 17 Pesticide Residues in Flour by QuEChERS/Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

LIU Yong-qiang1*,LIU Sheng2,XU Wen-juan1,LI Kai1,ZHANG Jing1,SUN Jun1

(1.Inspection and Quarantine Technology Center,Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang 261041,China；2.Inspection and Quarantine Technology Center,Zibo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zibo 255035,China)

An analytical method was established for the simultaneous determination of 17 pesticide residues in flour by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS).The QuEChERS method was validated for the extraction.In this method,the samples were extracted with 0.1%(by volume)acetic acid-acetonitrile solution,and cleaned-up by PSA and C18adsorbents,then determined by UPLC-Q-TOF/MS with electrospray ionization in positive mode.The quantification analysis was performed by the external standard calibration.A database including accurate mass and fragment ions information was established.The correlation coefficients(r)were more than 0.995 in the linear range of the 17 pesticides.The limits of quantitation(LOQs)of the method were in the range of 5.0-10.0 μg/kg.The recoveries at three spiked levels were between 70.3%and 114.9%with relative standard deviations(RSDs,n=6)of 0.4%- 11.7%.With the advantages of simplicity and good stability,the method is available for practical application.

ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)；pesticide residues；flour；QuEChERS

2017-04-27；

2017-06-21

山東出入境檢驗檢疫局科研課題(SK201613)；國家質檢總局科技計劃項目(2016IK202)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.007

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2017)08-0986-06

*通訊作者：劉永強,碩士,高級工程師,研究方向:食品中農獸藥殘留檢測,Tel:0536-8582596,E-mail:liuyongqianga@163.com