超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中10種水楊酰胺類化合物

周 思，鄧 龍，林森煜，黃嘉樂，郭新東*

(1.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中10種水楊酰胺類化合物

周 思1，鄧 龍2，林森煜1，黃嘉樂1，郭新東1*

(1.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

建立了動物源性食品中10種水楊酰胺類化合物(5-氯水楊酰苯胺、4′-溴水楊酰苯胺、3′，4′ -二氯水楊酰苯胺、4′，5-二氯水楊酰苯胺、3′，4′，5 -三氯水楊酰苯胺、5-溴-4′-氯水楊酰苯胺、3，5-二溴水楊酰苯胺、4′，5-二溴水楊酰苯胺、3，4′，5-三溴水楊酰苯胺、3，3′，4′，5-四氯水楊酰苯胺)的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。樣品經乙腈萃取，氨基固相萃取小柱(SPE)凈化，T3色譜柱分離后，以甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫，串聯質譜電噴霧負模式掃描，多反應監測模式檢測，外標法定量。結果表明，10種目標物在一定范圍內線性關系良好，相關系數(r2)不小于0.995 7，檢出限為0.5～1.0 μg/kg，定量下限為1.5～3.0 μg/kg；加標水平為1.5～30.0 μg/kg時，回收率為81.0%～106%，相對標準偏差(RSD，n=6)不大于7.5%。該方法凈化效果好、定量準確、靈敏快速，適用于動物源性食品中10種水楊酰胺類化合物的檢測與確證。

動物源性食品；固相萃取(SPE)；水楊酰胺類化合物；超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)

水楊酰胺類化合物是一類人工合成的抗菌防霉劑，具有化學性質穩定、抗菌廣譜、高效低毒的特點，被廣泛應用于化工產品及農用飼料的防霉處理，亦作為除蟲藥和抗原生動物用藥在畜牧業和水產養殖中使用，對于肝片吸蟲、蛔蟲、絳蟲、血吸蟲等具有較好的驅殺作用[1-3]。然而，這類藥物的不當或過量使用會導致其在農產品中殘留，人體攝入后經血液循環分布于皮膚表面，接觸日光照射時發生光變態反應，導致日光蕁麻疹或接觸性光過敏性皮炎，危害人體健康[4]。日本肯定列表制度中的“現行標準”(MRLs List)規定牛肉及組織中3，4′，5-三溴水楊酰苯胺的限量為0.04 mg/kg，牛奶中的限量為0.01 mg/kg，其他未作限定的人工合成抗菌物質視作“一般標準”(Uniform Limit)，總量不得超過0.01 mg/kg[5]。

目前，水楊酰胺類化合物的報道集中在化妝品[6-8]、皮革[9-10]、紡織品[11]和環境水體[12-14]等方面，有關食品中水楊酰胺類化合物的報道局限于某種組織或少數藥物殘留的檢測[2-3]。檢測方法以液相色譜法[3，6-7，14-15]居多，氣相色譜-質譜法[8-9，11-13]和液相色譜-質譜法[2]亦有少量報道。其中液相色譜法多以溶劑萃取后直接進行測試，但水楊酰胺類化合物的種類繁多，存在多種結構相似物和同分異構體，根據保留時間對目標物進行定性分析時易受干擾物影響而造成假陽性。本文選取10種水楊酰胺類化合物作為目標物，結合超高效液相色譜-串聯質譜儀在多殘留組分分析中準確、高效的特點[16-17]，通過優化樣品前處理方法、色譜條件，建立了動物源性食品中10種水楊酰胺類化合物的UPLC-MS/MS測定方法，可用于動物源性食品中水楊酰胺類化合物的檢測和確證，亦可作為過敏原排查的輔助手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，AB 4000QTRAP 三重四極桿串聯質譜儀(美國Absciex公司)；Milli-Q 去離子水發生器(美國Millipore公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；XHF-D勻漿機(寧波新芝生物科技公司)；3K15 高速離心機(美國Sigma公司)；N-EVAP 112水浴氮吹儀(美國 OA 公司)；固相萃取裝置(美國Waters公司)；WAX、MAX、HLB、C18固相萃取柱(3mL/60 mg，美國Waters公司)，NH2固相萃取柱(3 mL/200 mg，美國Supelco公司)

3′，4′-二氯水楊酰苯胺(3′，4′-Dichloro-salicylanilid)、4′，5-二氯水楊酰苯胺(4′，5-Dichloro-salicylanilid)、3′，4′，5-三氯水楊酰苯胺(3′，4′，5-Trichloro-salicylanilid)購于美國Sigma公司，5-氯水楊酰苯胺(5-Chlorosalicylanilid)、4′-溴水楊酰苯胺(4′-Bromosalicylanilid)、5-溴-4′-氯水楊酰苯胺(5-Bromo-4′-chlorosalicylanilide)、3，5-二溴水楊酰苯胺(3，5-Dibromo-salicylanilid)、4′，5-二溴水楊酰苯胺(4′，5-Dibromo-salicylanilid)、3，4′，5-三溴水楊酰苯胺(3，4′，5-Tribromo-salicylanilid)、3，3′，4′，5-四氯水楊酰苯胺(3，3′，4′，5-Tetrachloro-salicylanilid)購于安譜公司，所有標準品純度均大于98%。甲酸(色譜純，德國CNW公司)，乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷(色譜純，德國Merck公司)，去離子水(18.0 MΩ·cm，由Milli-Q去離子水發生器制備)。

10種目標物用乙腈配成1.00 g/L的單標儲備液，保存于4 ℃冰箱；分別吸取適量的單標儲備液，用乙腈稀釋成濃度均為5.00 mg/L的混合標準溶液，使用時，用乙腈逐級稀釋成濃度為1.0、2.5、5.0、20.0、100、500 μg/L的系列標準工作溶液。

試樣包括牛肉、羊肉、魚肉、牛肝、牛奶等共17個樣品，均購于廣州市農貿市場。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters UPLCTMHSS T3 柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A為甲醇，B為 0.1%甲酸水溶液，流動相梯度洗脫程序：0 ～2.0 min，40%～10% B；2.0～8.0 min，10% B；8.0～8.1 min，10%～40%B；8.1～10 min，40% B；進樣體積：5 μL；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃。

1.2.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI-)；監測方式：多反應監測(MRM)模式；電噴霧電壓：-4 200 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：25 psi；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi；相應的監測離子對(m/z)、去簇電壓和碰撞電壓等參數見表 1。

表1 10種水楊酰胺類化合物的監測條件

* quantitative ion

1.3 樣品前處理

1.3.1 肌肉、內臟、水產品 稱取勻漿后的樣品2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水，渦旋1 min，加入5 mL乙腈和2 g氯化鈉，渦旋2 min，超聲10 min，以4 000 r/min離心2 min，吸取乙腈層至25 mL氮吹管中，殘渣中加入5 mL乙腈重復萃取，合并乙腈提取液。常溫下氮氣吹干，加入2 mL正己烷-二氯甲烷(9∶1，體積比)溶解殘渣，渦旋混勻，待凈化。

1.3.2 牛 奶 稱取搖勻后的樣品2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈和2 g氯化鈉，渦旋2 min，超聲10 min，4 000 r/min離心2 min，吸取乙腈層至25 mL氮吹管中，常溫下氮氣吹干，加入2 mL正己烷-二氯甲烷(9∶1)溶解殘渣，渦旋混勻，待凈化。

1.4 樣品凈化

氨基固相萃取柱預先加入10 mL丙酮和5 mL正己烷活化，將前述提取溶液轉移至氨基固相萃取柱中，以 1.0 mL/min流速過柱。待上清液流出后，用5 mL正己烷洗滌，負壓抽干后用6 mL 5%甲酸丙酮溶液洗脫，常溫下水浴氮氣吹干，加入1.0 mL乙腈溶解殘渣，15 000 r/min高速離心后，供 UPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

動物源性食品種類眾多，成分較為復雜，主要干擾物為蛋白質及脂肪，此外還有少量色素，需結合水楊酰胺類化合物的特性，篩選出一種通用的提取條件。向勻漿后的樣品中加入少量水可起分散樣品的作用，有利于有機萃取溶劑與樣品的充分接觸，提高樣品的提取效率。根據目標物的理化性質，并參考文獻報道[2，6-7]，本實驗對比了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷4 種萃取溶劑的提取效果。實驗發現，用乙酸乙酯萃取易發生乳化，甲醇與水互溶，不利于后續凈化，而采用乙腈(加氯化鈉飽和)和正己烷進行萃取，均有較好的回收率，但用正己烷萃取樣品的同時萃取出大量脂肪，增加了后續凈化處理的難度，而乙腈對脂肪的溶解性較差，在萃取目標物的同時還能沉淀樣品中的蛋白質，減少了樣品基質的干擾，因此選擇乙腈作為最佳萃取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

圖1 3種固相萃取柱對目標物提取效果的比較(n=4)Fig.1 Comparison on recoveries of targets on three different SPE columns(n=4) the number denoted was the same as that in Table 1

為了進一步除去提取液中的干擾物質，本實驗采用固相萃取技術對樣品提取液進行凈化。鑒于酰胺類化合物具有微弱的堿性，本實驗選取C18、HLB、WCX、MCX和NH2固相萃取柱進行凈化。稱取陰性畜肉樣品2.0 g，加500 μL質量濃度為100 μg/L的混合標準溶液，用溶劑萃取后，進行固相萃取凈化。實驗發現，HLB和C18柱通過反相吸附機理發生作用，對于目標物和大部分共萃雜質的區分度不高，使用HLB和C18柱凈化后，在對洗脫液進行濃縮處理時，有少量固體析出，較難進行后續處理；其他3種柱的加標回收情況如圖1所示。NH2柱在用極性較小的溶劑上柱時，既可通過偶極-偶極作用吸附酰胺類化合物，也可通過形成氫鍵與目標物發生較強的相互作用，與WCX柱和MCX柱相比，NH2柱對目標物具有更好的選擇性。綜合比較，選擇NH2固相萃取柱對提取液進行凈化。

進一步考察了甲醇、二氯甲烷、丙酮和5%甲酸丙酮4種溶劑的洗脫效果。結果表明，由于目標物與吸附劑之間作用強烈，丙酮、甲醇和二氯甲烷均難以將3，4′，5-三溴水楊酰苯胺和3，3′，4′，5-四氯水楊酰苯胺洗脫下來，以5%甲酸丙酮為洗脫液時的回收率最佳。實驗進一步考察了洗脫溶劑用量(1～7 mL)對待測化合物回收率的影響，結果表明，洗脫溶劑體積為6 mL時目標物的回收率基本達到平衡。

2.3 儀器條件的優化

2.3.1 質譜條件的優化 將質量濃度為0.5 mg/L的水楊酰胺單標溶液，在電噴霧離子源下分別進行正離子和負離子模式全掃描分析，所有待測化合物均在負離子模式下獲得響應最佳的準分子離子峰，這與目標物的結構特點相符合。在此基礎上，通過選擇離子監測方式分別優化每個化合物的碎裂電壓，然后采用子離子全掃描分析，優化碰撞能量；根據歐盟2002/657/EC決議中有關質譜分析方法必須不少于4分的規定[18]，為每個待測物選取最佳的兩對MRM離子對及相應的參數作為最終的質譜采集參數(見表1)。

2.3.2 色譜柱的選擇 已有文獻顯示[6-7]，測定酰胺類化合物的常用液相色譜柱為C18色譜柱，因此本實驗考察了UPLC常用的HSS T3 柱(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)、BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)和PFP 柱(50 mm × 2.0 mm，2.6 μm)的分離效果。結果顯示，PFP柱對于3，5-二溴水楊酰苯胺和4′，5-二溴水楊酰苯胺，3′，4′-二氯水楊酰苯胺和4′，5-二氯水楊酰苯胺兩對同分異構體的分離效果不佳，而這兩組化合物的離子碎片相似，難以單獨定量。BEH C18柱上色譜峰的峰形較HSS T3柱寬，這是由于HSS T3柱的填充顆粒比表面積大，理論塔板數高，因而峰形更加尖銳，目標物在HSS T3柱上分離效果更好，故本文選用HSS T3柱作進一步的色譜條件優化。

圖2 10種目標物的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 10 target compounds the number denoted was the same as that in Table 1

2.3.3 流動相的選擇 本文涉及的10種目標物結構性質相似，選擇梯度洗脫有利于改善峰形，提高極性相似化合物的分離度。實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液4種流動相對10種目標物色譜峰行為的影響。結果表明，4種流動相組合均可實現目標物的分離，使用甲醇作有機相時，目標物中的2組同分異構體的分離度更高，使用0.1%甲酸溶液作水相時，酸的加入抑制了目標物上酚羥基的電離，減少了氫鍵等相互作用，獲得了更好的峰形。因此，選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為梯度洗脫溶劑。在優化條件下，10種目標化合物的多反應監測色譜圖如圖2所示。

2.4 線性范圍與檢出限

在優化條件下，對“1.1”配制的混合標準溶液進行測試。以目標物的質量濃度(x，μg /L)為橫坐標，定量離子的峰面積(y)為縱坐標作圖，得到10種水楊酰胺類化合物的線性方程(見表2)。由表2可知，10種目標物在一定濃度范圍內線性關系良好，相關系數均不小于0.995 7。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，S/N=10計算定量下限(LOQ)，得10種水楊酰胺類化合物的LOD為0.5～1.0 μg/kg，LOQ為1.5～3.0 μg/kg，表明本方法具有較高的靈敏度。

表2 10種待測物的線性范圍、線性方程、相關系數、方法檢出限及定量下限

the number denoted was the same as that in Table 1

2.5 回收率與精密度

選取陰性的牛肉、豬肝、蝦、牛奶樣品分別進行3個水平的加標回收實驗，6次平行實驗的結果見表3。由表可知，在加標濃度范圍內，10種待測物的平均回收率為81.0%～106%，相對標準偏差(RSD，n=6)為3.5%～7.5%，說明該方法具有良好的回收率與精密度。

表3 加標回收率與相對標準偏差測定結果(n=6)

the number denoted was the same as that in Table 1

2.6 實際樣品的檢測

日本肯定列表制度中規定了牛肉及組織、牛奶中3，4′，5-三溴水楊酰苯胺的限量[5]，表明這類化合物有可能被使用并在動物源性食品中殘留。本方法檢出限低至1.5 μg/kg以下，滿足限量監測要求。隨機購買的17個樣品均未檢出目標化合物，在一定程度上表明該類藥物在行業性和區域性使用情況良好。

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定動物源性食品中5-氯水楊酰苯胺、4′-溴水楊酰苯胺、3′，4′ -二氯水楊酰苯胺、4′，5-二氯水楊酰苯胺、3′，4′，5-三氯水楊酰苯胺、5-溴-4′-氯水楊酰苯胺、3，5-二溴水楊酰苯胺、4′，5-二溴水楊酰苯胺、3，4′，5-三溴水楊酰苯胺、3，3′，4′，5-四氯水楊酰苯胺10種水楊酰胺類化合物的檢測方法。方法準確、靈敏，具有良好的回收率和精密度，可為動物源性食品中水楊酰胺類化合物的定性定量分析提供一種可靠的檢測方法。

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[18] 2002/657/EC Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results，Commission Decision.

Determination of 10 Kinds of Salicylamides in Foods of Animal Origin by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Si1，DENG Long2，LIN Sen-yu1，HUANG Jia-le1，GUO Xin-dong1*

(1.Guangzhou Inspection and Testing Certification Group Company Limited，Guangzhou 511447，China；2.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China)

A new method was developed for the determination of 10 kinds of salicylamides，including 5-chlorosalicylanilid，4′-bromosalicylanilid，3′，4′-dichloro-salicylanilid，4′，5-dichloro-salicylanilid，3′，4′，5-trichloro-salicylanilid，5-bromo-4′-chlorosalicylanilide，3，5-dibromo-salicylanilid，4′，5-dibromo-salicylanilid，3，4′，5-tribromo-salicylanilid and 3，3′，4′，5-tetrachloro-salicylanilid in foods of animal origin using solid phase extraction(SPE) combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Samples were extracted using acetonitrile,and purified with an amino(NH2) SPE column.The eluent was concentrated by nitrogen gas blowing.10 target compounds were separated on a T3 column(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) by gradient elution with methanol-0.1% formic acid as mobile phase，ionized by negative electrospray ionization(ESI-)，detected under multiple reaction monitoring(MRM) mode，and quantified by the external standard method.Under the optimized condition，the calibration curves of 10 kinds of salicylamides were linear in a certain concentration range with correlation coefficients(r2) no less than 0.995 7.The limits of detection(LODs，S/N=3) and limits of quantitation(LOQs，S/N=10) for the target compounds were in the ranges of 0.5-1.0 μg/kg and 1.5-3.0 μg/kg，respectively.The average recoveries at three spiked levels ranged from 81.0% to 106%，with relative standard deviations(RSD，n=6) no more than 7.5%.The method was suitable for the identification and quantification of 10 kinds of salicylamides in foods of animal origin.

foods of animal origin；solid phase extraction(SPE)；salicylamides；ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

2017-04-05；

2017-05-15

廣東省質量技術監督局科技項目(2016PZ09)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.003

O657.72；TQ572.41

A

1004-4957(2017)08-0963-06

*通訊作者：郭新東，博士，教授級高級工程師，研究方向: 色譜-質譜檢測方法，Tel: 020-83376692，E-mail: gdone@21cn.com