花椒中典型酰胺類物質的提取工藝優化研究

劉福權，巫碧清，趙志峰，何強

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

花椒中典型酰胺類物質的提取工藝優化研究

劉福權，巫碧清，趙志峰*，何強

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

為了獲得高質量的花椒酰胺類物質，文章采用有機溶劑萃取法進行提取，并利用HPLC法測定花椒中酰胺類物質的含量，在單因素實驗的基礎上應用響應面法對提取溫度、料液比和提取時間進行三因素三水平的優化設計。結果表明：溫度與料液比的交互作用明顯，而溫度與時間、料液比與時間的交互作用不顯著(p>0.05)；最佳提取工藝為溫度43 ℃，料液比1∶15，時間4.5 h，此條件下的提取率可達7.68%，理論預測值為7.32%。該研究為提取花椒中典型的酰胺類物質提供了參考。

花椒；酰胺類物質；提取工藝；響應面分析

花椒(Zanthoxylumbungeanum)系蕓香科花椒屬植物，其成熟干燥的果皮作為一種傳統的香辛料長期存在于亞洲人的廚房中，因其具有獨特的“麻味”以及唾液分泌性質而被譽為中國“八大味”之一[1]。花椒中的酰胺類物質是山椒素和花椒素類物質的總稱[2]，因其能通過激活觸覺和熱感應三叉神經的神經元產生“麻”這一感覺又被廣泛地稱為麻味物質[3]。從花椒中提取得到酰胺類物質不僅能夠為麻味研究提供基礎性原料，更是進一步研究其生物活性、藥理作用和神經科學分子機制的基礎性步驟[4-6]，因此花椒中典型酰胺類物質的提取工藝優化至關重要。目前常見的提取方法主要是有機溶劑萃取法和超臨界CO2萃取法。薛小輝[7]研究了青花椒麻味成分的超臨界CO2萃取工藝，得到了最優參數；劉雄[8]對比研究了有機溶劑法和超臨界CO2萃取法提取花椒中風味物質的工藝條件，得到了提取花椒油樹脂的最佳工藝參數，但是文章主要對精油得率進行了工藝優化，并未對花椒中典型的酰胺類物質的有機溶劑提取進行研究。

近年來不斷發展的麻味評價方法對花椒中的酰胺類物質提出了更高的要求[9]，而超臨界CO2萃取法雖然具有諸多優點，但是因其設備昂貴而難以廣泛使用。本文擬通過有機溶劑萃取法提取花椒中典型的酰胺類物質，利用響應面法優化提取工藝參數，建立數學模型，分析不同因素對酰胺類物質提取的影響程度，以期為花椒麻味研究的基礎步驟提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花椒：由四川五豐黎紅食品有限公司提供，選用2015年8月采摘于四川漢源的鮮花椒，采收后于40 ℃條件下烘干，常溫避光保存備用。

甲醇、堿性氧化鋁、乙腈：成都科龍試劑廠；超純水。

1.1.2 儀器與設備

DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；RE52-99旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS低速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；SHZ-D循環水式真空泵 上海道京儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

分別考察提取溫度、時間和料液比對酰胺類物質提取率的影響。稱取粉碎至40目的花椒1 g，置于100 mL錐形瓶中，按設定的料液比加入分析純甲醇，在設定溫度下水浴加熱一定時間后，減壓抽濾。濾液減壓蒸干(50 ℃)后加入10 mL分析純甲醇，超聲波輔助溶解。將所得混合溶液過堿性氧化鋁層析柱，收集層析液。所得層析液經離心(4000 r/min，10 min)后，取上清液減壓蒸干并計重，所得樣品即為酰胺類物質提取物。

1.2.2 響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上，根據Box-Benhnken的中心組合設計原理，采用響應面法對花椒中酰胺類物質提取工藝參數進行三因素三水平的優化實驗。選取提取溫度、時間和料液比為自變量，分別用A，B，C表示，以花椒酰胺類物質提取率為響應值，用R表示。實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素和水平

1.2.3 酰胺類物質的檢測

1.2.3.1 標準曲線的繪制

將實驗室自制的羥基-α-山椒素標準品配制成不同濃度的溶液，采用HPLC法進行檢測，色譜條件：MN Nucleodur 1100-5 C18柱；流動相A：水；流動相B：乙腈；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：270 nm；進樣量：20 μL。洗脫程序見表2。

表2 HPLC洗脫程序

以各濃度溶液在270 nm下吸收峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得到標準曲線方程為y=198648x，R2=0.998，式中：x為麻味物質的質量濃度(μg/mL)，y為270 nm下吸收峰的面積。

1.2.3.2 酰胺類物質含量的測定

取一定量的提取物用色譜級甲醇溶解后過0.22 μm濾膜，使用高效液相色譜儀進行測定，根據標準曲線換算得到花椒中酰胺類物質的含量。

1.2.3.3 酰胺類物質提取率的計算

酰胺類物質提取率(ER)計算公式如下：

式中：c為酰胺類物質質量濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；d為樣品溶液稀釋倍數；G為樣品的質量，g。

1.2.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 21進行處理，方差分析采用Duncan模型進行多重比較，顯著性水平為5%，采用Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 溫度對酰胺類物質提取率的影響

考察在30，40，50，60 ℃條件下，提取溫度對花椒酰胺類物質提取率的影響，結果見圖1。

圖1 溫度對酰胺類物質提取率的影響

由圖1可知，當溫度為40 ℃時，提取率最大，隨著溫度繼續升高，提取率開始下降，溫度對提取率的影響顯著(p<0.05)。

當溫度較低時，隨著溫度的升高，分子熱運動速率加快，在相同時間內，花椒中酰胺類物質的溶出隨著溫度的升高而增加。但當溫度較高時，溫度的繼續升高將導致溶劑蒸發速率加快，在相同時間內，體系的料液比降低，提取率下降。此外，由于酰胺類物質為熱敏性物質，在高溫下不穩定，溫度較高可能會導致其發生轉化或降解[10]，由此也導致提取率下降。

2.1.2 時間對酰胺類物質提取率的影響

考察溫度在40 ℃條件下，提取時間對花椒酰胺類物質提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取時間對酰胺類物質提取率的影響

由圖2可知，花椒中酰胺類物質的提取率在4 h時達到最大值，隨著時間延長，6～8 h花椒麻味物質提取率有所下降，但在10 h時又出現峰值，隨后提取率繼續降低。在2～12 h內，時間對提取率具有顯著影響(p<0.05)。

出現2個峰值的原因可能是4 h時正好是1個分離周期，而隨著時間延長，花椒中酰胺類物質又進行了1次分離。但是相比第1個分離周期，第2個分離周期所得到的酰胺類物質有所減少，這可能是因為經過1次分離后有機溶劑中已經存在酰胺類物質，導致濃度差減小，傳質推動力下降。

2.1.3 料液比對酰胺類物質提取率的影響

考察溫度為40 ℃、時間為4 h條件下，料液比對花椒酰胺類物質提取率的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對酰胺類物質提取率的影響

由圖3可知，當料液比為1∶15時，酰胺類物質的提取率最大，料液比對提取率的影響顯著(p<0.05)。當料液比小于1∶15時，提取率隨著料液比的增加而增加，而當料液比大于1∶15時，由于提取已經達到動態平衡，料液比的增加并不會繼續提高酰胺類物質提取率，反而由于后續需要延長減壓蒸干的時間所導致的酰胺類物質部分分解而有所下降。

2.2 響應面實驗結果

采用Box-Benhnken中心組合對酰胺類物質的提取率進行優化設計，結果見表3。

表3 花椒中酰胺類物質提取響應面實驗設計及結果

續 表

由表3可知，回歸模型的顯著性檢驗p=0.1524>0.05，差異不顯著，說明該模型擬合程度不好。因此，需要進一步對模型進行逐步回歸分析，得到回歸方程為：R=6.44736+0.16052A+0.65773B-0.80348A2。

方差分析見表4。

表4 方差分析表

注：“*”為影響顯著(0.01

由表4可知，回歸方程的失擬性檢驗p=0.3002>0.05，差異不顯著，這表明所選用的二次回歸模型是適當的；回歸模型的顯著性檢驗p=0.0106<0.05，差異顯著，說明該模型擬合程度好，模型成立。因此，在所選的3個因素中，提取溫度和料液比對花椒酰胺類物質提取率具有顯著影響，而提取時間作為不顯著因素被剔除，表明提取時間對于花椒酰胺類物質提取率并無顯著影響。

由分析結果可知，當溫度為43.08 ℃、料液比為0.06、時間為4.45 h時，提取效果最好，提取率為7.32%。因此，選擇最佳提取工藝參數為溫度43 ℃，料液比1∶15，時間4.5 h。

回歸模型的響應曲面圖及其等高線圖見圖4～圖6。

圖4 料液比和提取溫度的交互作用

圖5 溫度和提取時間的交互作用

圖6 料液比和提取時間的交互作用

由圖4～圖6可知，提取溫度與料液比的響應曲面圖較為陡峭，且交互的等高線圖近似橢圓形，說明提取溫度與料液比的交互作用較為明顯。而提取溫度與提取時間、料液比與提取時間的響應曲面圖較為平緩，且交互的等高線圖近似圓形，表明提取溫度與提取時間、料液比與提取時間的交互作用并不顯著(p>0.05)，該結果與方差分析結果相吻合。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，通過響應面優化實驗得到采用有機溶劑萃取法提取花椒中典型酰胺類物質的最優參數為提取溫度43 ℃，料液比1∶15，提取時間4.5 h，此條件下提取率可達7.68%。本文通過逐步回歸模型成功擬合得到了提取率的方程，闡述了提取溫度和料液比對酰胺類物質提取率具有顯著影響，而提取時間無顯著影響。

本文較為系統地闡述了花椒中典型酰胺類物質的提取優化過程，得到了以甲醇為溶劑條件下的最佳提取工藝，但在不同溶劑下酰胺類物質傳質過程的對比研究還鮮有報道，或可作為未來研究的方向。

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Research on Optimization of Extraction Process ofTypical Amides inZanthoxylumbungeanum

LIU Fu-quan, WU Bi-qing, ZHAO Zhi-feng*, HE Qiang

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, SichuanUniversity, Chengdu 610065, China)

To obtain the high-quality amides fromZanthoxylumbungeanum, the organic solvent extraction is used and the amides content ofZanthoxylumbungeanumis determined by HPLC. On the basis of single factor experiment, the response surface method is applied to extraction temperature,solid-liquid ratio and extraction time for optimal design of three factors and three levels. The results show that the interaction between temperature and solid-liquid ratio is obvious, however, the interaction between temperature and time as well as the interaction between solid-liquid ratio and time are not significant(p>0.05).And the optimal extraction process is temperature of 43 ℃, solid-liquid ratio of 1∶15,time of 4.5 h, the extraction rate can reach 7.68% under such conditions, and the predicted value is 7.32%. The study can provide a reference for the extraction of typical amides fromZanthoxylumbungeanum.

Zanthoxylumbungeanum;amides;extraction process;response surface analysis

2017-02-20 *通訊作者

國家自然科學基金(21502128)

劉福權(1992-)，男，遼寧撫順人，碩士，研究方向：食物資源利用。

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.006

1000-9973(2017)08-0025-05