芳香化酶（P450arom）在黃鱔性腺、腦組織中的定位

張厚梅+王琳

摘 要：為了揭示芳香化酶與黃鱔（Monopterus albus）性逆轉之間的內在聯系和作用機理，以不同性別黃鱔的性腺和腦組織為試驗材料，采用免疫組化方法檢測芳香化酶在不同性別黃鱔的性腺和腦組織上的定位及其變化趨勢。免疫組化結果顯示：在雌性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母細胞的胞質上，卵膜、胞核和不成熟的卵母細胞呈陰性；在雌雄間性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在的退化卵母細胞膜和縱隔上；在雄性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在各級精母細胞上。芳香化酶在腦組織中均有分布，并且其染色程度隨著黃鱔由雌性轉換為雄性而趨于減弱。這意味著黃鱔性腺和腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉過程，且與其性別轉化密切相關。

關鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；芳香化酶；性逆轉

中圖分類號：S965.1文獻標識碼：A

在脊椎動物發育過程中，胚胎的早期，原始性腺是呈中性的，它具有分化為卵巢或精巢的雙向潛能。在魚類進化過程中，鹽度、pH值、溫度以及外源性激素等均可影響其性別分化的方向。芳香化酶能催化雄激素轉化為雌激素，它是性腺分化的核心酶，芳香化酶可能調控著性別分化的方向。李廣麗[1]用芳香化酶抑制劑進行腹部埋植，結果發現，血清11-酮基睪酮水平顯著提高，且能誘導赤點石斑魚（Epinephelus arkoya）由雌性轉變為雄性。另外，在性別形成階段，使用芳香化酶抑制劑可以使基因型為雌性的羅非魚（Oreochromis niloticus）、鮭魚（Oncorhvnchus tschawytscha）轉變為功能性雄性魚[2-3] 。到目前為止，已有斑馬魚（Barchydanio rerio）、羅非魚等[4-5]的芳香化酶基因片段被分離和克隆，并研究了該基因與性別分化的關系。近年來，越來越多的研究結果表明，芳香化酶與魚類性別分化密切相關。黃鱔（Monopterus albus），隸屬于合鰓目、合鰓科，是我國主要淡水養殖產品之一。黃鱔從胚胎發生階段到性成熟階段， 都為雌性， 性成熟以后即可產生卵子， 但在產卵以后， 卵巢慢慢退化消失，逐漸轉變為精巢， 隨后就可以產生成熟精子，變為雄性，即具有極為罕見的性逆轉生理現象。目前，關于芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細胞學分布規律仍較少研究。

本試驗以黃鱔為試驗動物，應用免疫組化技術系統觀察芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細胞學分布規律，為進一步探討芳香化酶如何調控動物生殖活動的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和主要試劑

2016年4-12月份，從安徽省肥西縣境內共采購活體野生黃鱔128尾，實驗室暫養，隨后分批進行解剖，收集黃鱔性腺和腦垂體，試驗時，黃鱔體重為50～180 g，兔抗P450arom 抗體（A7981）購自美國 Sigma公司，PV-9000兩步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物處理 將上述黃鱔處死，迅速分離大腦、性腺等組織，立即投入多聚甲醛（4%）溶液中進行固定，倒出固定液，用微流水沖洗組織12 h左右，使用不同濃度酒精順序脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm）

1.2.2 免疫組織化學步驟

（1）切片常規脫蠟至水；（2）熱修復抗原；（3）滅活內源性酶；（4）滴加一抗P450arom；（5）按照免疫組化檢測試劑盒說明，滴加試劑1、2；（6）DAB 顯色，蒸餾水洗滌；（7）蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.2.3 顯微鏡觀察 在顯微鏡下觀察拍照，陰性對照組呈藍色，陽性產物染色呈棕黃色。

2 結果與分析

2.1 芳香化酶（P450arom）在黃鱔性腺組織中的定位

2.1.1 芳香化酶在雌性黃鱔性腺上的定位

雌性黃鱔性腺上可觀察到大小不一的卵粒，P450arom主要分布在成熟卵母細胞的胞質上（圖1B），卵膜、胞核和不成熟的卵母細胞及對照組（圖1A、B）呈陰性。

2.1.2 芳香化酶在雌雄間性黃鱔性腺上的定位

雌雄間性黃鱔性腺形態學觀察結果顯示，既可觀察到卵母細胞，還可觀察到結締組織縱隔和在縱隔形成的管狀結構的早期精細管。P450arom主要分布在退化卵母細胞膜（圖2B）和縱隔（圖 2D）上。

2.1.3 芳香化酶在雄性黃鱔性腺上的定位

雄性黃鱔組織切片中可觀察到精母細胞，且帶有黑色斑點，P450arom主要分布在各級精母細胞上，染色較淺（圖3）。

2.2 芳香化酶（P450arom）在黃鱔腦組織中的定位

在黃鱔的腦組織中，芳香化酶主要分布在神經細胞的胞核內（圖4 A、B、C）。對照組無陽性細胞（圖4 D）。且芳香化酶在雌性（圖4 A）雌雄間性（圖4 B）、雄性（圖4 C）黃鱔的腦組織中的染色越來越淺。

3 討論

黃鱔屬于硬骨魚綱，黃鱔亞科，是一種具有天然單向性逆轉特性的動物。雌性發育的第一個周期內黃鱔個體性腺全部表現為雌性特征，性成熟后，卵巢內卵細胞逐漸凋亡，卵巢結構趨于退化，與此同時雄性生殖細胞開始發育，通過雌雄間性發育過渡到雄性表征。

目前關于魚類性腺分化的機理目前尚不清楚，現有的研究結果更多的是傾向于性激素比率假說和下丘腦控制學說[6]，認為魚類性腺分化與雄激素/ 雌激素比值的高低密切相關，而芳香化酶能夠催化睪酮轉化為雌二醇，所以芳香化酶與魚類性腺分化可能存在潛在的聯系。本實驗通過免疫組化技術系統研究芳香化酶在黃鱔性腺和腦組織上的分布。

在雌性黃鱔的性腺中，可清晰地看到不同形狀的卵母細胞，不少卵黃顆粒沉積在細胞內，有的卵黃顆粒充滿整個卵母細胞，核也逐漸邊移。同時，卵巢內存在少數一、二期的卵母細胞。免疫組化結果表明，芳香化酶主要分布在成熟卵母細胞的胞質上，不成熟的卵母細胞、卵泡膜和胞核呈陰性。由此看來，成熟卵母細胞轉換雄激素為雌激素的能力大于未成熟的卵母細胞。同時，我們發現卵泡體積越大，染色越深，這意味著芳香化酶的活性隨著卵泡體積的增大而增加。

在雌雄間性的黃鱔中，顯微鏡下可見較少的細小卵細胞，但幾乎不能發育成熟，而是逐漸凋亡吸收，同時可看到曲精小管的雛形。芳香化酶主要分布在退化卵母細胞膜和縱隔上。其染色較淺，意味著活性減弱，芳香化酶活性減弱直接導致血液中雌二醇水平降低，從而加快了卵母細胞退化速度，促進雄性生殖細胞增殖。

在雄性黃鱔中，可見未成熟的精巢細長，表面有色素斑點，黑色斑點可能是卵母細胞退化凋亡的痕跡。顯微鏡下可見曲精小管及精子，成熟的黃鱔精巢表面有黑色細紋，并且存在大量成熟的精子。免疫組化結果顯示，芳香化酶在黃鱔睪丸中的表達呈弱陽性，主要分布在睪丸間質細胞、支持細胞和生精細胞中。杜啟艷等[7]采用半定量RT-PCR方法研究芳香化酶在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）各組織中的表達時發現在睪丸中幾乎無表達。由此可見，芳香化酶在不同魚類睪丸中的表達并不一致。

芳香化酶在腦組織免疫組化結果表明，它主要分布在神經細胞內，這意味著它可能直接參與調節雌激素的合成，從而影響黃鱔的性別分化。芳香化酶可能在中樞神經系統上參與調節神經內分泌[8]。這和其他魚類P450arom 在腦組織的表達研究結果不完全相同[9]。Kishida M使用Northern 雜交發現P450arom在斑馬魚的腦沒有表達[10]。造成各研究結果不同可能與所研究魚的類別、生長發育階段有關。芳香化酶在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔的腦組織中的染色越來越淺，這意味著芳香化酶的活性愈來愈弱，即雌激素的水平愈來愈低。

由此看來，黃鱔中芳香化酶的活性與個體發育階段和性別密切相關，這與Anderson E[11]的結果類似。同時進一步證明了芳香化酶參與黃鱔的性逆轉過程，通過生殖軸對未分化的性腺產生影響，進而影響腦和性腺的性別分化。目前，對黃鱔的性逆轉發生的機制并沒有徹底研究清楚，有必要對芳香化酶進行進一步研究，以闡明黃鱔腦及性腺性別決定和分化的機制。

參考文獻：

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