血管內皮祖細胞對骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞脂肪化的影響

溫 麗，常 平，蔡 川，李 銳

血管內皮祖細胞對骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞脂肪化的影響

溫 麗，常 平，蔡 川，李 銳

目的 探討血管內皮祖細胞(endothelialprogenitorcell，EPC)對骨質疏松(OP)大鼠骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC)自主脂肪化的影響。方法 選6周齡雌性SD大鼠，建立OP模型。體外分離、培養大鼠EPC、BMSC。分別取第3、6代BMSC及原代EPC，建立EPC/BMSC間接共培養體系。實驗分組：假手術組BMSC(BMSCsham)、OP組BMSC(BMSCovx)、OPBMSC/EPC共培養組(BMSCovx/EPC)；MTT法檢測細胞增殖情況；油紅O染色檢測成脂分化情況，real-timePCR檢測成脂分化標志物PPARγ2的mRNA表達水平。結果BMSCovx/EPC組BMSC的增殖能力顯著高于BMSCovx組；BMSCovx/EPC組自主脂肪細胞分化水平明顯低于BMSCovx組。結論EPC可通過間接接觸提高骨質疏松大鼠BMSC的增殖能力，并能有效抑制OP大鼠BMSC的自主脂肪化。

血管內皮祖細胞；間充質干細胞；骨質疏松；細胞增殖；成脂分化

眾所周知，增齡或絕經后的骨質疏松(osteoporosis, OP)患者，其骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)會自發地向終末脂肪細胞分化，導致骨髓脂肪化[1, 2]。因此，如何逆轉或抑制骨髓脂肪化，增強BMSC的干細胞功能，是近年來研究OP預防和治療細胞學的新方向[3, 4]。自1997年發現血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cell, EPC)以來，已證實它具有形成新生血管、改善微環境等功能。近期有學者將EPC的這些生物學功能應用于干細胞的研究中，并經初步證實EPC可以有效維護長期體外培養BMSC的干細胞功能特性，提高正常或OP情況下BMSC移植后的骨修復功能[5-7]。因此，利用EPC來促進OP環境下BMSC的活性和功能，并以期達到有效抑制骨髓的自主脂肪化的效果，在理論上是有充分依據的。本實驗通過細胞間接共培養方式，探討EPC是否具有調節OP大鼠BMSC細胞活性和自主脂肪細胞分化的功能，為絕經后OP的治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雌性SD大鼠20只(原第四軍醫大學實驗動物中心提供)，體質量200 g左右。Siemens Inveon Mirco-CT(μCT，Siemens，德國)，α- MEM培養基(Gibco，美國)，EGM-2 BulletKit培養基(Clonetics，美國)，Dil標記的乙酰低密度脂蛋白(Dil-acLDL，L3484，Molecular probe，美國)，異硫氰酸熒光素標記的荊豆凝集素I(FITC-UEA-I，FLl061，Vector，美國)，Transwell小室(Coming，美國)，油紅O(Sigma，美國)，酶聯免疫檢測儀(Beckman-Coulter，美國)，反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit，Takara，日本)。

1.2 方法 采用經典的卵巢去勢法建立OP模型：將大鼠隨機分為假手術組(sham 組)和去卵巢手術組( ovx 組)，每組10只，術后增齡3個月，顯微CT(μCT)掃描確定OP模型的建立。密度梯度法結合差速貼壁法培養大鼠BMSC并進行細胞鑒定。分步預接種法培養大鼠骨髓EPC[5]并進行細胞鑒定[5, 8]。7 d后收集EPC建立Tanswell(0.4 μm孔徑)BMSC ovx/EPC間接共培養體系。MTT法檢測細胞的增殖及活性。油紅O染色及酶聯免疫檢測儀檢測細胞的成脂分化能力。Real-time PCR檢測成脂基因的表達，引物序列如下：β-actin 上游引物序列，5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；下游引物序列：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(250 bp，NM_001101)；PPARγ2上游引物序列：5′-AGTGGAGACCGCCCAGG-3′，下游引物序列：5′-GCAGCAGGTTGTCTTGGATGT-3′(64bp，NM_013124)。反應條件如下：95 ℃ 2 min，和95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，共45個循環。以ΔΔCT相對定量法計算目的基因mRNA的相對含量[9]。

1.3 統計學處理 用SPSS 19.0軟件，采用Q-Q圖和Levene檢驗法檢驗數據的正態性和方差齊性。兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，同組內兩兩比較采用LSD(L)法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠OP模型評估 μCT掃描顯示ovx組骨小梁排列較Sham組稀疏，骨小梁密度減小，骨量降低(圖1)。測定兩組骨小梁數量顯示，ovx組為(0.747±0.082)mm，Sham組為(1.791±0.086)mm，差異有統計學意義(P<0.05)。說明雙側卵巢摘除后構建大鼠OP模型成功。

圖1 μCT掃描觀察大鼠股骨的骨組織結構

2.2 BMSC鑒定 體外分離培養出的BMSC經定向誘導后可以向成骨細胞和脂肪細胞分化(圖2)。流式細胞儀檢測該細胞高表達間充質細胞表面分子CD90[(98.457±1.636)%]、CD105[(95.898±1.575)%]，以及干細胞抗原Sca-1(61.389±6.115%)，幾乎不表達造血干細胞標志物CD34[(1.373±0.325)%]和CD45[(1.525±0.484)%]。

圖2 BMSC經定向誘導后分化情況

A.成骨誘導21 d，細胞外基質中有礦化結節形成(茜素紅染色×40)；B.成脂誘導14 d，細胞中有紅色脂滴形成(油紅O染色×40)

2.3 EPC鑒定 在倒置顯微鏡下連續觀察可以發現，EPC原代細胞的形態從初期的長梭形逐漸轉變為鋪路石狀；熒光顯微鏡下可見，原代細胞Dil-acLDL及FITC-UEA-I雙重熒光染色結果呈陽性(圖3)。

2.4 EPC對OP大鼠BMSC增殖的影響 BMSC ovx組細胞增殖能力明顯低于BMSC sham組(P<0.05)，并隨著傳代次數的增加，其增殖能力呈逐漸下降趨勢。而BMSC ovx/EPC組細胞的增殖能力顯著高于BMSC ovx組(P<0.05，表1、2)。

項目樣本量OD值3d5d7d10dFPBMSC(sham)70．295±0．0420．379±0．0240．388±0．0180．368±0．03313．1580．000BMSC(ovx)70．223±0．0350．327±0．034①0．318±0．027①0．310±0．019①19．1000．000BMSC(ovx)/EPC70．272±0．0440．355±0．048①0．385±0．0580．364±0．066①5．7850．004F5．8563．4977．3523．764P0．0110．0520．0050．043

注：與上一組組間比較，①P<0.05

項目樣本量OD值3d5d7d10dFPBMSC(sham)70．195±0．0210．222±0．0290．258±0．0300．268±0．0309．9710．000BMSC(ovx)70．168±0．023①0．200±0．0160．188±0．018①0．204±0．017①5．0990．007BMSC(ovx)/EPC70．193±0．0240．206±0．0120．266±0．038①0．256±0．029①12．1140．000F3．0222．15414．28011．773P0．0740．1450．0000．001

注：與上一組組間比較，①P<0.05

圖3 EPC原代細胞的形態(×40)

A.EPC接種7 d；B. EPC接種10 d；C. EPC攝取Dil-acLDL后呈現紅色熒光；D. EPC攝取FITC-UEA-I后呈現綠色熒光

2.5 EPC對OP大鼠BMSC自主脂肪化的影響 油紅O染色顯示，BMSC ovx組細胞增殖較慢，且在細胞集落中出現較多的脂肪細胞。相比之下，BMSC ovx/EPC組中，其BMSC的細胞數量增加，脂肪細胞形成的數量明顯減少。利用酶聯免疫檢測儀檢測每組的吸光度值(表3)，結果顯示，BMSC ovx組脂肪細胞數量顯著高于BMSC sham組(P<0.05)，而BMSC ovx/EPC組明顯低于BMSC ovx組(P<0.05)。另外，PPARγ2的定量分析結果顯示，BMSC ovx組細胞PPARγ2的表達顯著高于BMSC sham組(P<0.05)，而在BMSC ovx/EPC組中的表達量明顯降低(P<0.05,表4)。

組別樣本量OD值P3P6tPBMSC(sham)70．096±0．0190．098±0．017-0．1610．875BMSC(ovx)70．133±0．027①0．181±0．010①-4．3020．001BMSC(ovx)/EPC70．111±0．0260．126±0．022①-1．1890．257F4．08243．706P0．0350．000

注：與上一組比較，①P<0.05

項目樣本量ΔΔCT值P3P6tPBMSC(sham)70．998±0．0781．008±0．050-0．2860．780BMSC(ovx)71．476±0．150①1．875±0．111①-5．6620．000BMSC(ovx)/EPC71．069±0．293①1．244±0．116①-1．4690．167F12．221149．772P0．0000．000

注：與上一組比較，①P<0.05

3 討 論

隨著干細胞在OP中的研究日趨成熟，對OP細胞學病理機制的認知也達到了一個新的高度。早期學者認為，OP 骨形成減少的病理機制是骨髓中BMSC成骨量和成骨功能的下降[2, 10]，因此可以通過增強干細胞的成骨分化能力來治療OP[11, 12]。隨后人們又發現，OP患者骨髓中脂肪細胞增多可能是導致骨髓成骨能力降低的原因，主要的核心機制可能是BMSC向成骨和成脂細胞分化平衡的紊亂[13]。因此，通過調節OP中BMSC的成脂、成骨分化的平衡，抑制成脂促進成骨分化也成為干細胞治療OP的方法之一[14, 15]。近年來，通過對OP骨髓中BMSC生物學特性的進一步研究發現，OP不僅僅與BMSC定向分化的平衡紊亂有關，還與其細胞干性降低或丟失密切相關[16]。在本實驗中，筆者也觀察到了BMSC ovx組的細胞增殖速度變慢，并且隨著傳代次數的增加，其增殖速度呈逐漸遞減趨勢。另外，BMSC ovx組傳代至第3代時，細胞胞質中開始有明顯的脂滴形成，并且隨著體外擴增倍數的增加，脂滴的數量也在增多。以上BMSC ovx組細胞一系列的生物學特性的變化都呈現出OP大鼠BMSC的生長狀態不良，隨著傳代增加，將逐漸變為沒有增殖能力的終末脂肪分化細胞。據此進一步推測，OP的產生可能與骨髓“老化”、BMSC干性丟失密切相關。因此，本文將如何提高OP骨髓中BMSC的干性功能，以抑制其自主脂肪分化作為研究初衷，以期為OP的干細胞治療提供新思路。

EPC是一群具有干細胞和內皮細胞的雙重特性的祖細胞，可在早期表達干細胞、晚期表達內皮細胞的相關抗原。然而對于體外如何能夠分離培養出真正的EPC尚存在爭議[17, 18]。本實驗利用連續預接種法從大鼠骨髓中成功獲得了EPC。鏡下可觀察到EPC形態的連續性變化，細胞從初始的長梭形祖細胞逐漸變成鋪路石樣的內皮細胞，并且具備內皮細胞功能。EPC具有形成新生血管的能力，因此，在改善局部微循環和微環境方面具有獨特優勢。本課題組的前期研究結果已證實，EPC通過間接接觸可以有效維持BMSC在體外培養時的干性特征[5]。在本實驗中，筆者觀察到EPC間接共培養對BMSC ovx組細胞的增殖能力有積極的調控作用。另外，我們還觀察到EPC的間接接觸可以明顯抑制BMSC ovx組細胞的自主成脂分化。PPARγ2是目前最具有脂肪細胞特異性的轉錄因子，其與配體結合后可直接或間接調節 BMSCs 的成脂分化[19]。本實驗中，筆者檢測到PPARγ2在BMSC ovx組中高表達，且隨著細胞傳代次數的增加，該轉錄因子的表達呈逐漸遞增狀態，而EPC的間接接觸可以顯著降低PPARγ2的表達，并且在多次傳代后能夠穩定在較低的水平。由此說明，EPC可以正向調控OP大鼠BMSC的增殖能力，而負向抑制BMSC的自主成脂分化。

EPC與BMSC同源于骨髓，彼此間相互影響，構成一個包括細胞及細胞因子或細胞信號的微環境。這種“原始”態的微環境對BMSC的干性調控是比較有優勢的。根據以上實驗結果，可以初步揭示EPC的微環境具有調控OP大鼠BMSC干性的潛能，而抑制其向終末脂肪細胞的自主分化是否是通過調控其干性功能來達到的，仍需要大量的實驗來進行驗證。探索一種理想的微環境將OP骨髓中的BMSCs恢復到未分化的狀態，抑制骨髓脂肪化，可能成為治療骨質疏松的新思路。

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(2017-03-10收稿 2017-06-10修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Effect of endothelial progenitor cells on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of osteoporosis rats

WEN Li, CHANG Ping,CAI Chuan,and LI Rui.
Institute of Stomatology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Objective To investigate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) of osteoporosis rats in order to provide a new strategy for prevention and treatment of osteoporosis.Methods An osteoporosis animal model was established with six-week-old female SD rats. EPCs and BMSCs of these rats were cultivated and identified in vitro. BMSCs at passage 3 and 6 were used respectively to establish a BMSC-EPC indirect co-culture system on transwell inserts. The experimental groups included the BMSC sham group, BMSC ovx group and BMSC ovx/EPC indirect co-culture group. MTT assay was applied to measure the cellular proliferation while Oil Red O solution was used to detect lipid droplets within the cells. Real-time PCR analyses were performed to analyze the expression of adipogenic marker PPARγ2.Results Under indirect co-culture conditions, EPCs could significantly promote the proliferation of BMSCs(ovx) and greatly inhibit the cells’capacity of self-adipogenic differentiation. Co-cultured EPCs resulted in a better proliferative ability of BMSCs in the BMSC ovx/EPC group than in the BMSC ovx group. Furthermore, BMSCs in the BMSC ovx/EPC group had a lower self-adipogenic differentiation potential than in the BMSC ovx group, which was evidenced by Oil Red O staining quantification and mRNA expression levels of adipogenic marker gene PPARg2.Conclusions Under indirect co-culture conditions, EPCs can enhance the stem cells’ proliferation but notably inhibit autonomic adipogenic differentiation of BMSCs of osteoporosis rats.

endothelial progenitor cell; mesenchymal stem cell; osteoporosis; cell proliferation; adipogenic differentiation

醫學期刊常用字詞正誤對照表

國家自然科學基金資助項目(81602393)

溫 麗，博士，主治醫師。

100853 北京，解放軍總醫院口腔科

李 銳，E-mail：lzhglr@163.com

R329.28