酪酸梭菌對RSV感染加重的哮喘小鼠氣道炎癥的影響

郭穎　張娟　曾明華

[摘要] 目的 酪酸梭菌對RSV感染的哮喘小鼠模型氣道的炎癥反應的影響。 方法 6～8周齡雄性BALB/c小鼠36只，隨機分為對照組（NC）、模型組（PC）、酪酸梭菌治療組（LS），每組12只。除對照組（NC）以外，其余各組均采用卵清蛋白腹腔注射致敏和霧化吸入激發，建立小鼠哮喘模型，在哮喘模型建立后第二日用RSV隔日滴鼻，連續3次，復制急性病毒感染哮喘模型。對照組（NC）采用生理鹽水替代卵清蛋白和RSV。酪酸梭菌組（LS）于0～33天給予酪酸梭菌灌喂，每日1次，第34天計數支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的白細胞數目；制作肺組織的病理切片，進行HE染色和Masson染色，觀察肺組織病理變化；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測BALF與血清中細胞因子IFN-γ、BALF中IL-12、IL-5及血清中嗜酸性粒細胞趨化因子。 結果 與模型組（PC）相比，酪酸梭菌組（LS）小鼠BALF中白細胞總數明顯降低（P<0.01），BALF及血清中細胞因子IFN-γ、IL-12的水平升高（P<0.01），嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-5水平降低（P<0.01）。 結論 酪酸梭菌可減輕RSV感染的哮喘小鼠氣道炎癥，酪酸梭菌對于RSV感染的哮喘小鼠具有一定的治療作用。

[關鍵詞] 酪酸梭菌；支氣管哮喘；卵清蛋白；小鼠

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-31-06

[Abstract] Objective To explore the effect of Clostridium butyricum to aggravate airway inflammation in asthmatic mice infected with RSV. Methods 36 mice of 6-8 week old male BALB/c were randomly divided into control group（NC），model group（PC） and Clostridium butyricum treatment group（LS） with 12 mice in each.Except the control group（NC），all the other groups were treated with ovalbumin，intraperitoneal injection，sensitization and inhalation，the mouse asthma model was established.After the asthma model was established，second day RSV nasal drops were taken every other day for 3 times.The acute viral infection asthma model was copy.The control group（NC） was treated with normal saline instead of ovalbumin and RSV.Clostridium butyricum group（LS） in 0-33 days with Clostridium butyricum were fed 1 times a day，the number of leukocytes in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was counted for thirty-fourth days.Pathological sections of lung tissue were made and HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of lung tissue.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect BALF and serum levels of cytokines IFN-γ，IL-12，BALF，IL-5，and eosinophils in serum. Results Compared with the model group（PC），clostridium butyricum group（LS） the total number of white blood cells in BALF mice decreased significantly（P<0.01），the BALF and serum levels of cytokines IFN-，gamma，and IL-12 were elevated（P<0.01），and the levels of eosinophils，chemokines and IL-5 decreased（P<0.01）. Conclusion Clostridium butyricum can alleviate the airway inflammation of asthmatic mice infected with RSV.Clostridium butyricum has certain therapeutic effect for RSV infection in asthmatic mice.

[Key words] Clostridium butyricum；Bronchial asthma；Ovalbumin；Mice

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，全球目前有3億多哮喘患者，并以每10年增加50%的速度遞增[1-2]。呼吸道合胞病毒（RSV）是引起哮喘急性發作與加重的主要原因，近80%的兒童

哮喘急性發作或加重與呼吸道病毒感染有關[3]。其機制可能與氣道高反應性、T細胞活化、趨化因子分泌增加、全身免疫激活和氣道局部炎癥反應等相關[4]。在哮喘的臨床治療上糖皮質激素、β2受體激動劑等已被廣泛成熟的應用，一些微生態制劑的應用是兒童哮喘治療的新思路，實驗證明取得了一定的療效，但是關于益生菌對于RSV加重的哮喘的作用少有研究。

酪酸梭菌（costridium butyricum）又稱酪酸梭狀芽胞桿菌，具有極強的整腸作用，它可抑制腸道中的致病菌，促進腸道中有益菌如雙歧桿菌和乳桿菌的生長[5-6]。此前我們課題組研究證明，酪酸梭菌可以通過抑制過敏誘導的Th2細胞因子和OVA特異性IgE及IgG1的產生、降低小鼠BALF中炎細胞總數、改善肺部病理變化減輕哮喘小鼠氣道炎癥[7]。因此，本實驗目的在于進一步研究酪酸梭菌對RSV感染加重的哮喘小鼠氣道炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

卵清蛋白OVA（美國Sigma公司），氫氧化鋁（天津市天力化學試劑公司） ，酪酸梭菌（山東科興生物制品有限公司），Hep-2細胞株（西京醫院兒科實驗室），呼吸道合胞病毒A亞型（首都兒科研究所），空壓霧化器（歐姆龍大連有限公司）。

1.2 病毒的細胞培養

在含10%胎牛血清的中培養Hep-2細胞，培養箱條件為37℃、5%CO2，待細胞鋪滿單層約70%后，將RSV病毒原液接種于Hep-2細胞。維持在原條件下繼續培養，3～5d即可出現細胞病變效應，待病變達80%以上收集病毒。采用TDID50測定病毒滴度。收集培養瓶中細胞懸液，在-80℃冰箱和37℃水浴反復凍融3次，離心后收集上清懸液，保存于-80℃冰箱中凍存備用[8]。

1.3 實驗動物與分組

36只8周齡SPF級BALB/c雄性小鼠，體重（20±2）g，購自第四軍醫大學實驗動物中心，飼養于第四軍醫大學基礎部動物房，隨機分為三組，每組12只，分別為對照組（NC組）、模型組（PC組）、酪酸梭菌治療組（LS組），用不含OVA的顆粒飼料喂養，自由飲水。整個過程遵守《實驗動物管理條例》。

1.4 模型的建立

實驗第0天、第7天和第14天給予模型組（PC組）、酪酸梭菌治療組（LS組）小鼠腹腔注射致敏液0.2mL（含100μg OVA及1.5mg Al（OH）3）進行致敏。對照組（NC組）小鼠采用生理鹽水溶液，注射部位及劑量與實驗組相同。實驗第21～28天給予PC組、LS組用含1%的OVA溶液作為霧化液激發。方法是將PC組、LS組兩組小鼠放在5L自制的密閉容器中，使小鼠暴露在1%OVA氣霧中，每日1次，每次30min。第29、31天每日給予上述1%OVA霧化；第28、30、32天給予體積100μL RSV上清液鼻腔滴入，共3次。待滴鼻第4天小鼠出現毛發豎立、無光澤，煩躁不安或精神萎靡，顫動或點頭、咳嗽及呼吸加深、節律性收腹樣喘促等陽性反應，表明RSV感染小鼠模型建立成功。對照組以生理鹽水代替OVA霧化激發和鼻腔滴入，頻次及時間同上。LS組于實驗第0～33天采用酪酸梭菌溶液進行灌胃（酪酸梭菌濃度5×108CFU/mL，即5g菌粉溶于10mL生理鹽水混勻后分裝，灌胃時每只小鼠0.2mL，-4℃保存。）其他兩組均采用等量生理鹽水代替酪酸梭菌溶液灌胃。

1.5 細胞因子檢測

在末次激發24h后處死小鼠，立即摘眼球取血，4℃、4000r/min，離心10min獲取血清。用自制穿刺針進行氣管插管并固定，用0.8mL滅菌的冷 PBS 溶液進行支氣管肺泡灌洗，10s后回抽，重復3次（回抽率>80%），將回抽的BALF于4℃，2500r/min，離心5min，收集上清液[9]。ELISA試劑盒檢測小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-5、IL-12及嗜酸性粒細胞趨化因子。具體步驟按照試劑盒說明書進行。用1mL無菌PBS溶液重懸離心后的沉淀，取0.1mL重懸液進行白細胞計數。

1.6 小鼠肺組織病理學變化的觀察

取各組小鼠的肺組織，按照H-E染色操作常規，經福爾馬林固定、脫蠟回水、包埋、切片后，分別觀察氣道周圍嗜酸粒細胞、氣道黏液分泌物及氣道周圍膠原增生的變化。

1.7 統計學處理

實驗采用SPSS17.0統計軟件，數據用（）表示，符合正態分布且方差齊者，多組間比較采用One-Way ANOVA法，組間兩兩比較采用LSD法；數據不符合正態分布者，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用 Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV與Hep-2細胞孵育后的變化

未感染RSV的Hep-2細胞貼壁生長，形成單層鋪路石樣細胞，排列規則緊密，互相嵌合成多邊形；RSV感染細胞后，出現細胞變圓、拉長及融合現象，鏡下可見細胞邊界不清，病變細胞相互融合呈“多核巨細胞”的合胞體，見圖1。

2.2 肺組織病理變化

肺組織HE染色顯示，NC組小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤較少，肺泡壁完整，PC組小鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯增多，肺泡腔明顯狹窄，肺泡壁斷裂，LS組小鼠肺組織炎癥較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤顯著減少，偶見肺泡壁斷裂及管腔狹窄。見圖2。Masson染色結果顯示，NC組小鼠氣道周圍膠原纖維沉積較少；PC組小鼠氣道周圍膠原纖維明顯增多；LS組小鼠氣道周圍膠原纖維沉積減少。見圖3。

2.3 BALF的炎癥細胞變化

與NC組小鼠相比，PC組小鼠BALF中白細胞分類計數中主要表現為嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及巨噬細胞的升高；LS組小鼠 BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及巨噬細胞明顯降低（P<0.01）。見圖4。

2.4 各組小鼠血清與BALF中IFN-γ、IL-12的檢測結果

與NC組相比，PC組小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-12水平明顯降低（P<0.01），LS組IFN-γ、IL-12可以明顯升高（P<0.01）。見圖5～6。

2.5 各組小鼠血清中嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-5含量

與NC組相比，PC組小鼠血清和BALF中嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-5水平明顯升高（P<0.01），酪酸梭菌可以降低哮喘小鼠嗜酸性粒細胞趨化因子與IL-5水平（P<0.01），見圖7～8。

3 討論

支氣管哮喘（bronchial asthma）是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。經典免疫學說認為，哮喘發病機制主要與Th1/Th2功能失衡相關，當哮喘發作時，Th2細胞功能亢進，可分泌大量細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等，促進炎癥反應。Th1可引發吞噬細胞介導的宿主防御應答，主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等，減少炎癥反應[10-11]。因此許多學者認為通過提高Th1細胞功能可達到抑制亢進的Th2反應，從而達到預防和治療哮喘的目的。IL-12是調節Th1分化的主要細胞因子：一方面，IL-12誘導Th1分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，加強了由它們介導的細胞免疫；另一方面，IL-12可抑制由Th2分泌IL-4、IL-5介導的體液免疫和IgE的升高，從而抑制哮喘的發生[12-13]。哮喘是一種以嗜酸粒細胞浸潤為特征的氣道炎癥性疾病[14]，嗜酸性粒細胞趨化因子是組織嗜酸性粒細胞增多的主要調解者，促炎細胞因子TNF-α和Th2型細胞因子IL-4各自誘導嗜酸性粒細胞趨化因子產生，并且它們的組合引起該產生顯著協同作用[15]。

呼吸道合胞病毒是嬰幼兒最為常見的呼吸道感染病原體[16-17]。由于RSV對氣道上皮細胞的破壞，導致由氣道成纖維細胞分泌的細胞因子增多引起炎性細胞啟動聚集，并抑制其凋亡[18]，使氣道重構加重，故加重哮喘發作。在我國各地，RSV每年都有流行，是導致急性下呼吸道感染的重要病原體[19]。

益生菌是一類在適當的攝入數量時會對宿主機體帶來益處的活體微生物[20]。酪酸梭菌是人體內有益菌之一[21-22]。近年來研究發現，益生菌制劑不僅可以用于治療消化道疾病，而且有降低炎癥介質、抗菌和提高機體免疫力的作用，在肺部感染和危重疾病等呼吸道疾病的治療方面的研究取得了較大的進展，給呼吸系統疾病的治療研究指出了新的研究方向[23]。

本實驗結果顯示，口服酪酸梭菌可降低RSV感染的哮喘小鼠血清和BALF中炎細胞總數、改善肺部病理變化，在一定程度上誘導RSV感染的哮喘小鼠分泌Th1細胞因子IFN-γ、IL-12上調，降低嗜酸性粒細胞趨化因子，減輕輕哮喘小鼠氣道炎癥，進一步推測酪酸梭菌作為一種常見的益生菌，對RSV感染的哮喘疾病有免疫調節和抗炎作用，能夠減輕炎癥反應，調節Th1/Th2細胞平衡，達到輔助防治哮喘的作用，但其臨床應用及其機制仍需進一步研究。

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（收稿日期：2017-05-09）