健脾益腎丸對腎臟纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號通路相關基因表達的研究*

深圳市中醫院中藥實驗室 深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室(深圳518033)

鄒美南 鄭 平 李中桂 鄭 琳 魏俊婷 王曼茹 江 霞 易鐵鋼△ 李順民△ 陳劍平 張尚斌

健脾益腎丸對腎臟纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號通路相關基因表達的研究*

深圳市中醫院中藥實驗室 深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室(深圳518033)

鄒美南 鄭 平 李中桂 鄭 琳 魏俊婷 王曼茹 江 霞 易鐵鋼△李順民△陳劍平 張尚斌

目的：研究健脾益腎丸對5/6腎切除大鼠模型腎損傷的改善作用，并分析探討其可能存在的機制。方法：40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、健脾益腎丸低劑量組(2.06 g/kg·d-1)、健脾益腎丸高劑量組(10.89 g/kg·d-1)、培哚普利組(4 mg/kg·d-1)，每組10只。造模4個月后開始給藥，連續給藥6周。6周后處死大鼠，留取血清，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)；采用實時熒光定量PCR法檢測腎組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA基因表達。結果：健脾益腎丸不同劑量均可明顯降低大鼠血清Scr、BUN水平(P<0.01/P<0.05)，下調TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA基因表達(P<0.01)；培哚普利作為西藥陽性對照，可明顯降低大鼠血清Scr、BUN水平(P<0.01/P<0.05)，下調TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA基因表達(P<0.01)。結論：健脾益腎丸能有效改善5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型腎功能；其機制可能與下調TGF-β1、Smad2、Smad3水平，從而抑制過度激活的TGF-β1/Smads信號通路有關。

健脾益腎丸；腎切除模型；腎纖維化；慢性腎衰；脾腎陽虛；TGF-β1/Smads信號通路

Effect ofJianpiYishenPill on Relative Gene Expression of TGF-β1/SmadsSignal Path in Rats with Renal FibrationChinese Medicine Laboratory, Shenzhen Hospital of Traditional Chinese MedicineKey Laboratory of Chinese Medicine Preparation, Shenzhen Hospital

健脾益腎丸是基于“玉屏風散”、《圣濟總錄》“四精丸”、《金匱要略》之“大黃甘草湯”，并結合治療慢性腎功能衰竭20余年的臨床經驗總結制成的中藥制劑。[1-2]該方由黃芪、白術、山藥、酒蓯蓉、白豆蔻、丹參、炙甘草及大黃8味藥組成，具有健脾益腎、活血化濁之功，主治慢性腎功能衰竭脾腎陽氣虛，兼有濕濁、水氣和瘀毒等癥。臨床上應用可降低各種尿毒癥毒素，改善臨床癥狀，延緩慢性腎衰的進展。腎臟纖維化是慢性腎臟疾病不斷進展的共同病理改變，是導致終末期腎衰竭的主要病因。[3]腎臟纖維化常伴有腎小管萎縮、間質炎性細胞浸潤、成纖維細胞聚積以及間質基質沉積等特征性病理改變。轉化生長因子-β1(TGF-β1)一直以來被認為在腎臟纖維化中重要的調控因子，而Smad2和Smad3則作為TGF-β1生物效應2個重要的下游調控因子。[4]近年來以TGF-β1、Smad2和Smad3為靶點的干預手段及抗腎纖維化的分子研究引起人們的關注。因此，筆者采用5/6腎切除大鼠模型，研究健脾益腎丸對慢性腎損傷的影響及可能機制，探討健脾益腎丸是否通過調控TGF-β1/Smads信號通路發揮作用，為健脾益腎丸臨床上防治慢性腎衰腎臟纖維化提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2013-0002，實驗動物質量合格證號：44007200026770。

1.2 藥品及試劑 健脾益腎丸(深圳市中醫院制劑科，批號20151221)；培哚普利〔施維雅(天津)制藥有限公司〕；肌酐(Scr)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160419)；尿素氮(BUN)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160415)； TransZol Up Plus RNA Kit(北京全式金生物技術有限公司,貨號：ER501)；TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(北京全式金生物技術有限公司,貨號：AH141)；TransStart Eva Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司,貨號：AQ501)。

1.3 儀器 J3000動物電子秤(G&G公司)；BS224S電子天平(1/萬)(德國SARTORIUS公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)；3K30離心機(美國SIGMA公司)；5424型小型高速離心機(德國 Eppendorf 公司)；-80℃ 超低溫冰箱(美國Thermo公司)；Varsoskan Flash多功能酶標儀(美國Thermo公司)；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR檢測系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 SD大鼠先適應性喂養7 d，隨機分為假手術組、模型對照組、健脾益腎丸高、低劑量組、培哚普利組，每組10只。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉動物,常規消毒鋪巾，從右背部切口，打開腹腔。靜脈夾夾住腎蒂后用高頻電刀切除右腎上下極(切除2/3)，止血后復位腎臟。2周后進行第2次手術，切除左側腎臟。假手術組采取同樣步驟打開腹腔，暴露腎臟后復位，避免牽拉腎臟。術后繼續飼養動物，期間密切觀察并記錄大鼠的體質量、毛發、精神狀態等情況。造模4個月后開始給藥，健脾益腎丸低劑量組按2.06 g/kg·d-1、高劑量按10.89 g/kg·d-1，培哚普利組按4 mg/kg·d-1，給藥量為10 mL/kg，實驗時以蒸餾水按劑量配制成所需濃度，其余各組給以相同量的蒸餾水，連續給藥6周。

2.2 標本采集 在給藥第6周末，眼球采集血液，并分離血清，-20℃保存。切取雙側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后，將腎組織置液氮中冷凍后，以-80℃冰箱保存以備后續指標檢測。

2.3 腎功能檢查 按試劑盒的操作說明，采用多功能酶標儀測定血清中Scr、BUN水平。

2.4 總RNA的提取及質檢 取-80 ℃ 凍存的腎組織標本，在液氮冷凍條件下使用研缽和研棒敲碎部分樣品后，取100 mg樣品充分研磨成粉末，按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書上要求進行總RNA提取，并使用100 μL RNase-free Water進行洗脫；最后使用Nanodrop進行濃度和純度檢測，取1 μL 總RNA進行1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷提取的總RNA的完整性。

2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達 采用TransScript II All-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR反轉錄試劑盒將2 μg 總RNA反轉錄成cDNA。以GAPDH為內參，采用相對定量2-△△Ct法計算。引物系列，TGF-β1引物上游：5’-AAC AAT TCC TGG CGT TAC CTT-3’，下游：5’-GCC CTG TAT TCC GTC TCC TT-3’，片段長度123 bp；smad2引物上游：5’-GAA CTG CGA ATA CGC TTT CAG T-3’，下游：5’-AGT GGG TAT AGT CAT CCA GAG GC-3’，片段長度155 bp；smad3引物上游：5’-CAG GGC TTT GAG GCT GTC TAC-3’，下游：5’-CAT CTG GGT GAG GAC CTT GTC-3’，片段長度171 bp； GAPDH為內參，引物上游：5’-CAG CCC AGA ACA TCA TCC CT-3’，下游：5’-CGG CAT GTC AGA TCC ACA AC-3’，片段長度105 bp。

3 結果

3.1 對5/6腎切除大鼠血清Scr、BUN的影響 與假手術組相比，模型對照組大鼠血清Scr、BUN含量顯著升高，差異具有非常顯著性(P< 0.01)。與模型對照組相比，健脾益腎丸高、低劑量組大鼠血清Scr含量明顯降低，差異具有顯著性(P< 0.01/P< 0.05)；健脾益腎丸高、低劑量組，培哚普利組血清BUN含量明顯降低，差異具有非常顯著性(P< 0.01)。結果見圖1。

注:與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型組比較，#P< 0.05，##P< 0.01

圖1 健脾益腎丸對5/6腎切除大鼠血清Scr、BUN的影響

3.2 各組大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達 與假手術組相比，模型對照組、健脾益腎丸組、培哚普利組TGF-β1 mRNA表達顯著升高，差異具有非常顯著性(P< 0.01)。與模型對照組相比，健脾益腎丸高、低劑量組、培哚普利組TGF-β1 mRNA表達明顯降低，差異具有非常顯著性(P< 0.01)。結果見圖2。

注:與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖2 健脾益腎丸對5/6腎切除大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達的影響

3.3 各組大鼠腎組織Smad2 mRNA表達 與假手術組相比，模型對照組Smad2 mRNA表達顯著升高，差異具有非常顯著性(P<0.01)。與模型對照組相比，健脾益腎丸高、低劑量組、培哚普利組Smad2 mRNA表達明顯降低，差異具有非常顯著性(P<0.01)；結果見圖3。

3.4 各組大鼠腎組織Smad3 mRNA表達 與假手術組相比，模型對照組Smad3 mRNA表達顯著升高，差異具有非常顯著性(P<0.01)。與模型對照組相比，健脾益腎丸高、低劑量組、培哚普利組Smad3 mRNA表達明顯降低，差異具有非常顯著性(P<0.01)；結果見圖4。

3 討論

調查研究顯示，慢性腎臟病在全球的發病率在8%～16%左右，而中國成年人群中慢性腎臟病的患病率約為10.8%，且該指標有逐年增高的趨勢。[5-6]腎臟纖維化是所有慢性腎臟疾病發展至終末期腎臟病的最后共同通路，目前針對腎病纖維化的治療沒有確切的西藥，而中醫在防治腎臟纖維化方面的作用逐漸引起關注。健脾益腎方是單位臨床應用20余年之驗方，其在改善慢性腎衰患者的蛋白尿、延緩腎功能進展方面有確切療效。臨床觀察顯示，該方能降低Scr和BUN水平，保護和穩定腎功能，提高患者的生活質量。[2，7]筆者在湯劑的基礎上經工藝篩選制成丸劑，[8]同樣證實健脾益腎丸可以顯著降低5/6腎切除模型大鼠血清Scr和BUN水平，改善大鼠的腎功能。

注:與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖3 健脾益腎丸對5/6腎切除大鼠腎組織Smad2 mRNA表達的影響

注:與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖4 健脾益腎丸對5/6腎切除大鼠腎組織Smad3 mRNA表達的影響

TGF-β1被認為是腎臟纖維化形成和發展的關鍵調控因子，而TGF-β1/Smads通路在腎臟纖維化的發生發展過程中起到重要的作用。TGF-β1與其受體結合后，激活下游的Smad2/3蛋白，并形成具有活性的復合物進入細胞核內，從而調節目的基因的轉錄，如各型膠原的表達，導致細胞外基質的積聚，引起腎臟纖維化的形成和發展。[9-11]因此，通過調控TGF-β1及下游Smad2/3等的表達，將是延緩腎臟纖維化的進程有效途徑。本研究結果顯示，健脾益腎丸能顯著降低5/6腎切除大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2/3的基因表達，提示健脾益腎丸可能通過TGF-β1/Smads信號通路發揮防治腎臟纖維化的作用。健脾益腎丸方中重用黃芪益氣健脾升陽運化為君；白術、山藥健脾補腎，以助腎臟氣化為臣；酒蓯蓉溫腎扶陽、潤腸通便，白豆蔻溫中化濕行氣共為佐藥；丹參活血祛瘀，大黃消癥散結、蕩滌腸胃、推陳致新共為使，可開啟脾胃升降之樞，通腑瀉濁，清解血分之毒；炙甘草健脾而調和諸藥。有研究報道，黃芪所含的有效成分黃芪甲苷能延緩通過調控TGF-β/Smads信號通路下調TGF-β1、Smad2/3和ɑ-SMA表達起到延緩糖尿病小鼠腎臟纖維化進程。[12]同樣，在體內外的研究中，以黃芪為君藥的中藥復方黃芪湯也能通過TGF-β/Smads通路改善腎臟纖維化。[13]此外，處方中丹參、大黃提取物及其含有的丹酚酸B和大黃酸也具有抗纖維化的作用。[14]筆者在前期健脾益腎丸的化學分析中測定該制劑含有黃芪甲苷、丹酚酸B等8個有效成分，[15]可以推斷健脾益腎丸抗腎臟纖維化可能是通過處方中多個成分共同起作用的結果，而確切有效物質基礎的研究將在是下一步的工作中進行。

本研究設定高、低2個劑量進行試驗，其中高劑量為臨床等效劑量，低劑量為1/4臨床等效劑量。研究結果顯示，劑量的高低與對大鼠的腎功能和腎臟基因表達作用不呈正比。健脾益腎丸高劑量組在下調BUN水平和Smad2/3表達方面優于低劑量組；而低劑量組在下調Scr水平和TGF-β1表達方面優于高劑量組。筆者推測可能設定的高、低劑量組處于藥物作用的平頂區，之后的量效篩選中設定劑量范圍時應整體調低。此外，本實驗未進一步測定腎臟組織中TGF-β1和Smad2/3的蛋白表達，這是本研究的不足之處。前期研究中，筆者采用ELISA法檢測顯示健脾益腎方湯劑可降低尿TGF-β1水平，[16]故推測健脾益腎丸對腎臟組織中TGF-β1和Smad2/3的蛋白表達與基因表達的趨勢一致，即可降低TGF-β1和Smad2/3的蛋白表達，但具體的結果需進一步的實驗確認。

[1]李順民，傅博，易鐵鋼，等.健脾益腎方(法)治療慢性腎功能衰竭及其營養不良的研究[J].中華中醫藥學刊，2008，26(10)：2 102-2 104

[2]李順民,楊曙東.健脾益腎方治療脾腎氣虛型慢性腎功能衰竭46例療效觀察[J]. 新中醫，2005，37(10)：36-37

[3]EddyAA,NeilsonEG. Chronic kidney disease progression [J].J Am Soc Nephrol, 2006, 17(11): 2 964-2 966

[4]LanHY. Diverse Roles of TGF-β/Smads in Renal Fibrosis and Inflammation [J]. Int J Biol Sci, 2011, 7(7): 1 056-1 067

[5]JhaV,Garcia-GarciaG,IsekiK, et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives [J]. Lancet, 2013, 382(9888): 260-172

[6]ZhangL,WangF,WangL, et al. Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional survey [J]. Lancet, 2012, 379(9818): 815-822

[7]易鐵鋼，祁愛蓉，易無庸.健脾益腎方治療慢性腎衰竭62例臨床觀察[J].中國中西醫結合腎病雜 志，2004，5(3)：149-151

[8]陳劍平，張尚斌，鄭平，等. 正交試驗優化健脾益腎丸的水提工藝[J]. 中國藥房，2016，27(34): 4 833-4 835

[9]KavsakP,RasmussenRK,CausingCG, et al. Smad7 binds to Smurf2 to form an E3 ubiquitin ligase that targets the TGF beta receptor for degradation [J]. Mol Cell, 2000, 6(6): 1 365-1 375

[10]EbisawaT,FukuchiM,MurakamiG, et al. Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation [J]. J Biol Chem, 2001, 276(16): 12 477-12 480

[11]楊彥裕，魏明剛，劉蔚，等. 芪歸益腎方對UUO小鼠腎組織TGF-1/Smads/PI3K信號通路的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22(6)：89-93

[12]WangY,LinC,RenQ, et al. Astragaloside effect on TGF-β1, SMAD2/3, and α-SMA expression in the kidney tissues of diabetic KKAy mice [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6):6 828-6 834

[13]ZhaoJ,WangL,CaoAL, et al. Huangqi decoction ameliorates renal fibrosis via TGF-β/Smad signaling pathway in vivo and in vitro [J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 38(5): 1 761-1 774

[14]HuQ,NoorM,WongYF, et al. In vitro anti-fibrotic activities of herbal compounds and herbs [J]. Nephrol Dial Transplant, 2009, 24(10): 3 033-3 041

[15]陳劍平，鄭平，李中桂，等. HPLC-MS法同時測定健脾益腎丸中8個成分的含量[J]. 藥物分析雜 志，2017，37(6)：962-967

[16]傅博，李順民，祁愛蓉，等. 健脾益腎方對5/6腎切除大鼠尿轉化因子-β1表達的影響[J]. 中國中西醫結合腎病雜志，2013,14(7)：599-600

(2017-07-07 收稿)

ZOUMei-nanZHENGPingLIZhong-guiZHENGLinWEIJun-tingWANGMan-ruJIANGXia

YITie-gangLIShun-minCHENJian-pingZHANGShang-bin

(Shenzhen 518033)

Objective: to study the improvement function ofJianpiYishenPill on renal injury of 5/6 nephrectomy in rats, and to explore the possible mechanism. Methods: 40 SD rats were randomly divided into sham operation group, control group, low dose ofJianpiYishenPill group (2.06 g/kg·d-1), high dose group (10.89 g/kg·d-1), and Perindopril group (4 mg/kg·d-1), 10 rats a group. 4 months after models finished, administration began and it lasted for 6 weeks. The rats were then killed with serum taken. Enzyme-linked immunosorbent test was used to detect serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN), and real-time fluorescence quantification PCR to detect gene expressions of TGF-β1, Smad2, Smad3 and mRNA. Results: both high and low dose ofJianpiYishenPill could significantly decrease Scr and BUN (P<0.01/P<0.05) and lower TGF-β1, Smad2, Smad3 and mRNA expressions (P<0.01); Perindopril could significantly decrease Scr and BUN (P<0.01/P<0.05) and lower TGF-β1, Smad2, Smad3 and mRNA expressions (P<0.01). Conclusion:JianpiYishenPill can effectively improve the renal function of 5/6 nephrectomy in rats with chronic renal failure, whose mechanism may be related to inhibiting the excessive activated TGF-β1/Smads signal path through lowering TGF-β1, Smad2 and Smad3.

JianpiYishenPill; nephrectomy model; renal fibration; chronic renal failure; spleen-kidney yang deficiency; TGF-β1/Smads signal path

*廣東省自然科學基金項目：No.2015A030310247； 廣東省中醫藥局項目：No.20162124； 深圳市科技計劃項目：No.JSGG20141017 103353178、 ZDSYS201606081515458、 JCYJ20160428182041577

張尚斌，男，主任藥師，研究方向：中藥新藥。

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0007-05

△深圳市中醫院腎病科(深圳 518033)