乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響*

河北中醫(yī)學(xué)院

康立英 李杰茹 韓聚強(qiáng) 李 斯(石家莊 050200)

乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響*

河北中醫(yī)學(xué)院

康立英 李杰茹 韓聚強(qiáng) 李 斯(石家莊 050200)

目的：觀察乳癖消顆粒對乳腺增生模型大鼠體內(nèi)雌激素(E2)含量、乳腺組織雌激素受體(ER)及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)蛋白表達(dá)的影響，探討乳癖消顆粒對雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法：用雌孕激素聯(lián)合造模制成大鼠乳腺增生模型，按照隨機(jī)分配的原則將所用實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組，即正常對照組，模型組對照組、乳癖消顆粒低、高劑量組和他莫昔芬陽性對照組。放免法檢測血清E2的含量,采用蛋白免疫印跡方法檢測乳腺組織ER、ERK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：乳癖消顆粒高、低劑量均可降低乳腺增生模型大鼠血清E2含量及乳腺增生組織ER、ERK的表達(dá)。結(jié)論：乳癖消顆粒通過影響乳腺增生大鼠體內(nèi)E2含量及乳腺組織中ER和ERK蛋白表達(dá)而調(diào)節(jié)雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

乳腺增生；乳癖消顆粒；ERK；雌激素；雌激素受體；雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；他莫昔芬

乳腺增生病是女性乳腺疾病中的常見病和多發(fā)病，已嚴(yán)重影響了女性的生活質(zhì)量，并且已被列為乳腺癌的癌前病變，因此早診斷、早治療是防治乳癌的關(guān)鍵之一。乳癖消具有消除結(jié)塊，緩解腫脹疼痛，活血化瘀，清熱解毒等功效，在多年的臨床應(yīng)用中，乳癖消對乳腺增生的臨床療效得到了多方面的肯定，但作用機(jī)制尚未完全明了，有待于對其分子機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。本研究通過觀察分析乳癖消顆粒對乳腺增生模型大鼠血清中的雌激素(E2)水平, 以及乳腺組織中雌激素受體(ER)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)的情況來探討乳癖消治療乳腺增生的分子作用機(jī)制，為臨床用藥提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 50只雌性未孕SD大鼠(體質(zhì)量180～220 g)購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。乳癖消顆粒(6 g生藥/8 g，哈爾濱泰華藥業(yè)股份有限公司)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司)，枸櫞酸他莫昔芬(蘇州第一制藥有限公司)，兔抗大鼠ER多克隆抗體、兔抗大鼠ERK多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 未孕雌性SD大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選出10只作為正常組對照組，給予肌肉注射生理鹽水10 mL/kg；其余大鼠用于復(fù)制乳腺增生模型，造模方法[1]：苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg肌肉注射，每天1次，連續(xù)25 d，隨后黃體酮4 mg/kg，肌肉注射，每天1次，連續(xù)5 d。造模成功后，將40只大鼠隨機(jī)分為：模型對照組、他莫昔芬陽性對照組(1.8 mg/kg)、乳癖消顆粒高劑量組(5.2 g/kg)，乳癖消顆粒低劑量組(1.3 g/kg)，每組10只，分別給予相應(yīng)劑量的藥物灌胃，每天1次，連續(xù)30 d；正常對照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷尾采血,3 000 r/min離心10 min，取血清,低溫保存(-20℃)備用。取右側(cè)乳腺組織立即置于液氮中速凍，而后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清E2水平檢測 采用放射免疫法測定各組大鼠血清E2含量，觀察大鼠血清激素水平變化情況。

1.4 Western blot法檢測乳腺組織中ER、ERK蛋白表達(dá) 將大鼠乳腺組織剪碎后和預(yù)冷的細(xì)胞裂解液一并置于勻漿器內(nèi)充分研磨，待組織完全裂解后，1 000～2 000 r/min離心8 min，取上清液，然后4℃，13 000 g離心10 min后取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白含量，紫光分光光度劑測蛋白濃度。各組取出50 μg總蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)移均在冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中進(jìn)行。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將硝酸纖維膜用溴酚藍(lán)染色，標(biāo)記相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參照位置。所用的硝酸纖維膜采用5%的脫脂奶粉TBS溶液封閉2 h，分別加入ER多克隆抗體(1∶300)、ERK多克隆抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)置于4℃冰箱孵育過夜，用TBST洗膜3次，接著二抗室溫孵育2 h，然后用TBST洗膜3次，每次10 min。添加顯色液，避光，顯色并直至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

結(jié)果分析：電泳后用數(shù)碼相機(jī)照相，采用Quantity One生物電泳圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)對區(qū)帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的蛋白的相對密度值時(shí)筆者采用GAPDH作為內(nèi)參。目的蛋白相對密度值的計(jì)算采用以下公式。目的蛋白相對密度值=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

2 結(jié)果

2.1 乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠血清E2含量的影響 數(shù)據(jù)顯示：與正常對照組大鼠相比，乳腺增生模型組大鼠血清中E2水平明顯增高 (P<0.05)；乳癖消顆粒高、低劑量組、他莫昔芬組大鼠血清E2含量明顯低于模型組(P<0.05)，詳見表1。

組別只數(shù) E2(pmol/L)t值P值正常組1057921±13951 模型組10123021±31803△5928<005他莫昔芬組1066966±10841?5276<005低乳癖消組1094815±9380?2690<005高乳癖消組1077250±9345?4367<005

注: 與正常組對比，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2.2 乳癖消顆粒對乳腺增生小鼠乳腺組織ER表達(dá)的影響 模型組大鼠乳腺組織ER表達(dá)量明顯高于正常對照組(P﹤0.01)；乳癖消顆粒高、低劑量組及他莫昔芬組明顯降低模型大鼠乳腺組織中ER蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見表2和圖1。

2.3 乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠乳腺組織ERK蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠乳腺組織中ERK蛋白表達(dá)量明顯高于正常對照組(P<0.01)；乳癖消顆粒各組及他莫昔芬組明顯減弱乳腺組織中ERK的蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見表2和圖2。

圖1 Western blot法檢測各組大鼠乳腺組織中ER的表達(dá)水平

(A:正常組，B：模型組，C:乳癖消低劑量組，D：乳癖消高劑量組，E：他莫昔芬組)

圖2 Western法檢測各組大鼠乳腺組織中ERK的表達(dá)水平

(A:正常對照組，B:模型組，C:乳癖消低劑量組，D:乳癖消高劑量組，E:他莫昔芬組)

組別只數(shù)ERERK正常組101023±0174 0768±0114 模型對照組102557±0233△1480±0200△他莫昔芬組101734±0207?0827±0103?低乳癖消組101914±0171?1272±0140?高乳癖消組101781±0181?0945±0164?

注：與正常組比較，△P<0.01;與模型組比較，*P<0.01

3 討論

性激素影響乳腺的生長發(fā)育,其對乳腺組織發(fā)揮生物效應(yīng)需要相應(yīng)受體介導(dǎo)。正常情況下雌激素E2與ER結(jié)合形成二聚體，激活核內(nèi)雌激素反應(yīng)元件發(fā)揮雌激素效應(yīng),進(jìn)而對乳腺上皮細(xì)胞的增生和代謝進(jìn)行調(diào)控。[2]當(dāng)E2水平過度升高時(shí)，過多的E2與ER受體結(jié)合，致使乳腺導(dǎo)管及腺泡上皮細(xì)胞增生過度，同時(shí)通過降低細(xì)胞免疫功能減弱乳腺組織的自我修復(fù)力，引起乳腺增生。增生的上皮細(xì)胞通過激素受體系統(tǒng)致乳腺組織ER合成增加，提高其對雌激素的敏感性，進(jìn)而促使乳腺上皮細(xì)胞增生。[3]有研究報(bào)道，雌、孕激素分泌紊亂[4-5]、雌、孕激素受體過量表達(dá)與乳腺增生癥的發(fā)生有密切的關(guān)系。[6-8]本研究中，模型對照組大鼠的血清E2含量和乳腺組織中的ER蛋白表達(dá)均較正常組明顯升高(P<0.01)，而與模型對照組比較，乳癖消顆粒高、低劑量組大鼠的E2含量和ER表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，提示乳癖消顆粒可以降低E2水平，減弱ER表達(dá)，從而抑制雌激素對乳腺組織的作用，從而限制了乳腺組織的增生。近年來，研究表明E2可激活乳腺上皮細(xì)胞中絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)的活性，雌激素誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞增生可能部分或全部由活化的MAPK級聯(lián)反應(yīng)信號途徑所介導(dǎo)。有報(bào)道顯示，乳腺癌細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路較正常乳腺組織中明顯升高。[9]ERK是MAPK家族的信號通路中之一。ERK的過度表達(dá)及激活,可能與乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，針刺、中藥可能通過抑制ERK蛋白的過度表達(dá)來抑制乳腺增生。[10-11]本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠的ERK蛋白表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.01)，而乳癖消顆粒高、低劑量組大鼠的ERK蛋白表達(dá)顯著低于模型對照組(P<0.01)，顯示乳癖消顆粒治療乳腺增生可能是通過影響雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而達(dá)到治療效果。

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(2017-06-07 收稿)

Effect ofRuPiXiaoGranula on Estrogen Signal Transduction Mechanism ofRats with Mammary Gland HyperplasiaHebei University of Chinese Medicine

KANGLi-yingLIJie-ruHANJu-qiangLISi

(Shijiazhuang 050200)

Objective: to observe the effect ofRuPiXiaoGranula on E2content, estrogen receptor (ER) of breast tissue and extracellular signal-regulated kinase (ERK) albumen expression in rats with mammary gland hyperplasia, and to explore the effect of the granula on estrogen signal transduction path. Methods: model rats with mammary gland hyperplasia made by estrogen associated with progestogen, were randomly divided into 5 groups: control group, model group, high dose ofRuPixiaogroup, low dose group, Tamoxifen positive group. Radio immunoassay (RIA) method was taken to detect E2content in serum, and western blotting taken to detect ER and EKR expressions. Results: both high and low dose group could decrease E2content, ER and EKR expressions in rats with mammary gland hyperplasia. Conclusion:RuPiXiaoGranula can regulate the estrogen signal transduction mechanism through affecting E2content, ER and EKR expressions in rats with mammary gland hyperplasia.

mammary gland hyperplasia;RuPiXiaoGranula; ERK; estrogen; ER; estrogen signal transduction; Tamoxifen

*河北省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目：No.152777131；河北中醫(yī)學(xué)院青年自然基金項(xiàng)目：No.QNZ2015012

韓聚強(qiáng)，男，副教授。

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0004-03