消癥軟肝方聯合5-氟尿嘧啶對H22荷瘤小鼠相關指標的影響*

河北省中醫院肝膽科

蘇春芝 都斗斗 李桑頤 郝艷超 楊澤江△(石家莊 050011)

消癥軟肝方聯合5-氟尿嘧啶對H22荷瘤小鼠相關指標的影響*

河北省中醫院肝膽科

蘇春芝 都斗斗 李桑頤 郝艷超 楊澤江△(石家莊 050011)

目的：探討中醫藥在肝癌的中西醫結合治療中所發揮的作用。方法：通過癌株傳代法建立H22肝癌小鼠模型，將造模成功的40只肝癌小鼠隨機分為模型組、消癥軟肝方組、5-氟尿嘧啶組以及消癥軟肝方聯合5-氟尿嘧啶組。中藥組以消癥軟肝方配方顆粒0.2 mL/d劑量灌胃治療，西藥組以5-氟尿嘧啶20 mg/kg·d-1腹腔注射治療，聯合用藥組給予中西藥物聯合治療，連續給藥12 d。結果：聯合用藥組小鼠的脾指數、胸腺指數明顯好于西藥組，抑瘤率和血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達都明顯優于中藥組和西藥組。結論：消癥軟肝方具有明顯的抗癌作用，能夠增強5-氟尿嘧啶的抗癌效果，其作用機制與抑制腫瘤血管生成有關。

原發性肝癌；消癥軟肝方;5-氟尿嘧啶；化濁解毒固本；疏肝柔肝；VEGF；MMP-9

原發性肝癌是一種極其常見的惡性腫瘤，具有隱匿性強、臨床發現晚、惡性程度高、轉移速度快等特點，[1]其死亡率在諸多癌癥中高居第二位。據統計，近年來肝癌發病率明顯上升，嚴重威脅著人們的健康。[2]在原發性肝癌的治療方面，現代西醫學一直占據著主導地位，但隨著肝癌治療領域的不斷深入，其副作用大、生存質量低、生存期短等弊端也日益彰顯。中西醫結合綜合療法治療原發性肝癌則彌補了肝癌治療學中的諸多不足。本研究立足于原發性肝癌治療和研究的現狀，建立動物實驗，擬通過觀察中藥治療、化學藥物治療以及中西醫聯合治療對H22荷瘤小鼠的不同作用點來深刻探討中醫藥在肝癌的中西醫結合治療中所發揮的作用。

1 實驗材料

1.1 動物和細胞 40只昆明小鼠，雄性，清潔級，體質量20～25 g，購買于河北省實驗動物中心(合格證編號1609116)。小鼠H22肝癌細胞株，由河北醫科大學生理教研室惠贈。

1.2 實驗藥物 消癥軟肝方配方顆粒：是筆者治療原發性肝癌的臨床經驗總結而成，主要由當歸12 g，川芎10 g，牡丹皮12 g，郁金15 g，甲珠10 g，牡蠣15 g，薏苡仁30 g，白花蛇舌草15 g，柴胡10 g，黃芩12 g，半夏9 g，白芍、枳殼、女貞子、旱蓮草各12 g等組成，由廣東一方制藥有限公司提供；氟尿嘧啶注射液(5-氟尿嘧啶)，規格：10 mL/0.25 g，天津金耀氨基酸有限公司。生產批號：1511121。

1.3 實驗試劑 免疫組化ABC試劑盒(美國Vector公司)；抗VEGF抗體工作液(北京博奧森生物技術有限公司)；抗MMP-9抗體工作液(北京博奧森生物技術有限公司)；DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)；PBS緩沖液(北京Solarbio公司)；正常山羊血清(武漢博士德生物技術有限公司)；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京鴻躍創新科技有限公司)。

1.4 實驗儀器 光學顯微鏡Olympus-BX63(日本Olympus公司)；HMIAS-2000顯微圖象分析系統(武漢同濟醫科大學)；MICROM-340E切片機(德國Zeiss公司)；精密電子天平(日本HM-200型)；干燥箱(日本三洋MIR-153型)；立式低溫冷藏箱DW-40L262(青島海爾醫用低溫科技有限公司)；DSHZ-300恒溫水浴箱(江蘇太倉醫用儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 造模和分組 將復蘇的H22腫瘤細胞接種于小鼠腹腔，待生長7 d后，小鼠產生大量癌性腹水，無菌操作抽取腹水，經過離心、去上清制成肝癌細胞懸液，調整懸液的細胞濃度至細胞數為1.0×107/mL。抽取0.2 mL肝癌細胞懸液經皮下注射建立移植瘤模型，注射結束后觀察造模小鼠的生命體征。造模成功后，將40只造模小鼠隨機分為4組，包括模型組(M)、消癥軟肝方組(Z)、5-氟尿嘧啶組(X)、消癥軟肝方聯合5-氟尿嘧啶組(L)，每組10只。

2.2 給藥方法 于H22荷瘤小鼠造模成功后進行給藥治療，中藥組給予消癥軟肝方配方顆粒0.2 mL/d灌胃治療(相當于生藥0.41 g)，西藥組給予小鼠5-氟尿嘧啶20 mg/kg·d-1，經皮下注射給藥。聯合用藥組每日上午給予同等劑量的消癥軟肝方制劑灌胃，下午皮下注射同等劑量5-氟尿嘧啶；模型組給予0.4 mL/d生理鹽水灌胃。連續治療12 d。

2.3 抑瘤率、脾指數、胸腺指數計算 將各實驗組小鼠的腫瘤組織、脾臟、胸腺等分別稱重，并計算抑瘤率、脾指數和胸腺指數，用以觀察不同藥物干預對肝癌小鼠的腫瘤生長及肌體免疫功能的影響。公式：抑瘤率=(模型組平均瘤體質量-治療組平均瘤體質量)/模型組平均瘤體質量×100%；脾指數=脾質量(mg)/小鼠體質量(g)×100%；胸腺指數=胸腺質量(mg)/小鼠體質量(g)×100%。

2.4 腫瘤組織中血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的免疫組化法測定 對腫瘤組織進行固定包埋、石蠟切片、脫蠟、抗原修復、封閉、一抗、二抗、DAB顯色、蘇木素復染、酒精梯度脫水、封片等免疫組化操作。結果判讀：每張組織切片上任意觀察10個視野(400倍)，以細胞內出現黃色、棕黃色或者褐色著色者為陽性，使用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統細胞測量程序測定VEGF、MMP-9反應陽性產物的平均光密度值，數值越高則說明腫瘤細胞數量越多。

2.5 腫瘤組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將H22荷瘤小鼠腫瘤組織的石蠟標本進行切片，每張切片厚度約2 μm，每例腫瘤組織取3張切片，HE染色后于電子光學顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織形態、結構的變化以及腫瘤細胞的生長情況。

3 結果

3.1 各治療組抑瘤情況 聯合用藥組瘤質量最小，抑瘤率最高，明顯高于中藥組和西藥組，差異有顯著性(P<0.05)；西藥組抑瘤率高于中藥組，差異有顯著性(P<0.05)。詳見表1。

表1 不同組小鼠腫瘤生長情況 ±s)

注: 與M組比較, ΔP<0.05; 與Z組比較, *P<0.05; 與X組比較, #P<0.05

3.2 各組小鼠免疫器官指數的比較 聯合用藥組脾指數、胸腺指數均明顯高于模型組和西藥組，差異有顯著性(P<0.05)；模型組、西藥組脾指數差異不明顯，(P>0.05)；中藥組和聯合用藥組胸腺指數相當，差異無顯著性(P>0.05)。詳見表2。

3.3 小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達 各組肝癌小鼠平均光密度值之間差異均有顯著性(P<0.05)；其中模型組平均光密度值明顯高于其它各組，差異有顯著性(P<0.05)；中藥組平均光密度值高于西藥組、聯合用藥組，差異顯著(P<0.05)；西藥組高于聯合用藥組，2組差異明顯，差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表3、圖1、圖2。

組別只數脾指數(%)胸腺指數(%)M104918±01351763±0176Z106601±0170#2612±0153#X104789±01501210±0132L95872±0163#2524±0124#??

注: 與X組比較, #P<0.05；與Z組比較, **P>0.05

表3 不同組小鼠腫瘤組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達

組別只數VEGF(MOD)MMP-9(MOD)M100161±00090171±0013Z100140±00090156±0012X100123±00160142±0012L90111±0013?#0128±0013?#

注: 與Z組比較, *P<0.05; 與X組比較, #P<0.05

圖1 小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白的表達

圖2 小鼠腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達

3.4 各實驗組小鼠腫瘤組織的形態學改變 模型組癌細胞數量繁多，且特異性強，細胞核細胞質嗜堿性很強，鏡下血管豐富；中藥組大量腫瘤細胞出現變性裂解，細胞質細胞核嗜酸性增強；西藥組明顯出現片狀腫瘤壞死區和空泡，細胞核呈現弱酸性；聯合用藥組部分腫瘤細胞發生壞死溶解，細胞質細胞核嗜酸性很強(見圖3)。

圖3 小鼠腫瘤組織的形態學變化

4 討論

本研究從治病求本的角度出發，筆者總結在治療原發性肝癌方面從醫多年的臨床經驗，擬名消癥軟肝方用于實驗。該方以化濁解毒[3]為基本思路，在疏肝、柔肝的基礎上，以柴胡作為引經藥，引活血、化濁諸藥直達病所，同時注重顧護脾腎，鼓舞正氣，從而實現以正服邪。方中環環緊扣，既不失傳統抗癌之專攻，亦不失剛柔并濟之調和。方中薏苡仁[4]、白花蛇舌草[5]能夠干擾腫瘤基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡；白芍[6]中的白芍總甙脂質可以明顯抑制SMMC-7721、K562、BEL-7402等腫瘤細胞的增殖，具有很強的抗腫瘤活性；川芎[7]的有效成分川芎嗪，可以抑制腫瘤組織VEGF蛋白的表達，誘導腫瘤血管內皮細胞凋亡；當歸[8]提取物當歸多糖通過調節肌體免疫功能可以起到明顯的抗腫瘤的作用；半夏[9]的重要活性成分半夏多糖可以通過激活網狀內皮系統起到抑制腫瘤細胞增殖的作用；柴胡[10]的有效成分柴胡皂甙，能夠誘導腫瘤細胞的凋亡和分化，控制腫瘤細胞的浸潤和轉移；王穎等通過動物實驗發現，牡蠣能使HAC肝癌小鼠下降的免疫指標明顯回升且瘤質量較模型組明顯減輕，認為牡蠣可能通過增強肌體免疫功能起到抗擊腫瘤的目的。[11]

研究結果顯示，消癥軟肝方具有明顯的抑瘤作用，與5-氟尿嘧啶聯合使用能夠增強5-氟尿嘧啶的抑瘤效果，其作用機制與抑制 腫瘤血管生成有關。同時，消癥軟肝方能夠改善5-氟尿嘧啶對H22荷瘤小鼠的免疫抑制作用，明顯增加肝癌小鼠的脾指數和胸腺指數，改善H22荷瘤小鼠的免疫功能。

[1]ParkinDM,BrayFJ,PisaoiP. Global cancer statistics, 2002[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians, 2005, 55(2): 74-108

[2]CHENW,ZHENGR,BAADEPD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. Can J Clin, 2016, 66(2): 115-132

[3]張紈, 李佃貴, 郭敏, 等. 化濁解毒調肝法對肝纖維化大鼠Smads表達的影響[J]. 中成藥, 2010, 32(3): 382-385

[4]樓婉婷, 朱珍, 谷滿倉. 薏苡仁抗腫瘤作用機制的研究新進展[C].2014年全國中藥學術研討會暨中國中西醫結合學會第六屆中藥專業委員會換屆改選會論文集, 2014.202-204

[5]吳逢選,周郁鴻,葉寶東. 白花蛇舌草抗腫瘤機制研究進展及其在血液病中的應用[J]. 中華中醫藥雜志, 2015, 30(1): 167-169

[6]覃雪峰, 張丹, 王娟, 等. 白芍總苷脂質體抗腫瘤活性研究[J]. 瀘州醫學院學報, 2014, 37(6): 557-560

[7]李萬玉, 徐曉玉, 楊辰鍇. 川芎嗪抗癌作用及其機制的分析[J]. 中醫當代醫藥, 2011, 18(22): 24-25

[8]曹蔚. 當歸多糖的結構與抗腫瘤作用及其機制研究[D]. 西安: 第四軍醫大學藥學系藥理學教研室, 2006. 1-160

[9]陳益. 半夏多糖的結構與抗腫瘤活性研究[D]. 西安: 陜西師范大學, 2007.1-80

[10]闕任燁, 李勇. 柴胡皂苷防治原發性肝癌機制研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報, 2014, 16(2): 128-131

[11]王穎, 馬安倫, 張惠珍. 牡蠣提取物抗腫瘤作用的實驗研究[J].中國海洋藥物雜志, 1997(1): 18-22

(2017-06-16 收稿)

Effect ofXiaozhengRuanganFormula Combined with 5-Fluorouracil onRelevant Indexes of H22Lumor-Bearing MiceHepatobiliary Department, Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine

SUChun-zhiDUDou-douLISang-yiHAOYan-chaoYANGZe-jiang

(Shijiazhuang 050011)

Objective: to explore the effect of Chinese medicine in treating hepatocarcinoma with combined therapy of TCM and western medicine. Methods: 40 H22hepatocarcinoma model mice, made by cancer strain passage method, were randomly divided into model group, Chinese medicine group (administrated withXiaozhengRuanganformula granules by 0.2 mL/d), western medicine group (injected with 5-fluorouracil by 20 mg/kg·d-1), and combination group. The administration lasted for 12 days. Results: spleen index and thymus gland index of combination group were obviously higher than that of western medicine group; inhibition rate, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expressions were superior to that of Chinese and western medicine groups. Conclusion:XiaozhengRuanganFormula has obvious anticancer effect and can enhance the antitumor effect of 5-fluorouracil, and its mechanism is related to the inhibition of tumor angiogenesis.

primary hepatocarcinoma;XiaozhengRuanganFormula; 5-fluorouracil; resolving turbidity, removing toxin and consolidating foundation; soothing liver and nourishing liver; VEGF; MMP-9

*河北省中醫藥管理局資助項目: No.2016037

R256.42

A

1007-5615(2017)04-0001-04

△河北醫科大學2015級碩士研究生(石家莊 050017)

實 驗 研 究