拜氏梭菌細胞固定化技術的研究

岳雨霞

摘 要：該文以海藻酸鈉和聚乙烯醇（PVA）為載體，以戊二醛為交聯劑，對拜氏梭菌進行了固定化技術的研究。通過單因素實驗和正交實驗，以總溶劑和丁醇產量及固定化小球的完整性為考核指標，確定了影響拜氏梭菌固定化技術的主要工藝參數：海藻酸鈉濃度為2%，PVA濃度7%，戊二醛添加量為2%，交聯時間4 h，交聯溫度37 ℃，丁醇產量最高可達11.72 g/L，總溶劑產量最高可達21.51 g/L。

關鍵詞：海藻酸鈉 PVA 交聯 拜氏梭菌 固定化

中圖分類號：Q81 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）06（a）-0139-02

固定化細胞技術是20世紀70年代興起的一種新型生物技術，是指利用物理或化學手段將游離的細胞或酶與固態的不溶性載體相結合，使其保持活性并可反復使用的一種技術[1]。該技術可以大幅度提高催化效率，減少所用微生物數量，微生物被高分子材料包埋，耐環境沖擊，產物易分離提取，操作穩定性好[2]。因此，固定化細胞技術在發酵工業中具有廣闊發展前景[3]。

微生物細胞的固定方法中吸附法具有操作簡單、固定化條件溫和、細胞活性損失小、載體可反復使用等優點，被廣泛應用和研究。海藻酸鈉具有化學穩定性好、無毒、包埋效率高等優點，適用于固定活細胞或敏感細胞，但其不耐熱，易破碎溶解，凝膠強度不夠，不利于多次使用。而聚乙烯醇凝膠強度較高，化學穩定性好，抗分解性能強，同時戊二醛能和細胞表面的基團發生交聯并形成網狀結構從而得到機械強度好的凝膠，因此，將PVA和海藻酸鈉結合，同時采用戊二醛[7]交聯可以使優勢得到加強。

文章以海藻酸鈉和PVA為載體，采用戊二醛交聯后吸附拜氏梭菌進行細胞固定化，研究了載體成球方式和固定化方法對溶劑產量的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種

拜氏梭菌，實驗室保藏菌種。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基

完全培養基（g/L）：酵母浸粉3.0 g，牛肉膏10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖5.0 g，L-半胱氨酸0.50 g，NaCI 5.0 g，NaAc 3.0 g，pH8.5。斜面培養基另加瓊脂20.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 基本發酵培養基

P2培養基（g/L）：葡萄糖，酵母粉，P2營養液。

P2營養液組成：（1）維生素液（g/L）：對-氨基苯甲酸0.10 g，硫胺素0.10 g，生物素0.001 g，（2）微量元素液（g/L）：KH2PO4 50.0 g，K2HPO4 50.0 g，NH4COOH 22.0 g，MgSO4.7H2O 20.0 g，MnSO4.H2O 1.0 g， FeSO4.7H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g。0.45 μm濾膜過濾滅菌。接種前將P2營養液以一定比例加入P2培養基中。

1.3 培養條件

1.3.1 種子培養

菌種由固體斜面接入種子培養基，39 ℃靜置培養24 h。

1.3.2 發酵培養

種子培養液75 ℃恒溫水浴下熱處理10 min后接種入發酵培養基，39 ℃下靜置培養72 h。

1.4 主要儀器設備

實驗中主要的儀器設備有：蒸汽滅菌器、電熱培養箱、氣相色譜、超聲波清洗器、離心機、精密電子天平。

1.5 試劑

實驗中使用的主要試劑有：硼酸、酵母浸提物、氯化鈣、海藻酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉、戊二醛、丙酮、丁酸等。

1.6 固定化工藝

1.6.1 工藝流程

載體→溶解→固化交聯→吸附菌體→發酵

1.6.2 操作要點

（1）溶解：先將PVA與海藻酸鈉浸泡6～12 h，再加熱溶解，滅菌備用。

（2）固化交聯：吸取PVA與海藻酸鈉溶液，無菌環境下滴入已配置好的含戊二醛和氯化鈣的硼酸飽和溶液中使成小球，設定溫度下靜置一段時間。

（3）吸附菌體：在無菌三角瓶中，將小球與菌液吸附一段時間后倒出菌液。

（4）發酵：將培養基倒入三角瓶中，39 ℃靜置培養72 h，檢測溶劑產量。

1.7 分析方法

1.7.1 溶劑產量的測定

（1）標準曲線的制作。

計算：根據溶劑和內標的峰面積比和質量比，結果如下：

乙醇：y=1.4546x-7E-05，R2=0.9991

丙酮：y=1.3689x-0.0343，R2=0.9984

丁醇：y=1.0491x-0.047，R2=0.9966

式中：x為與內標的峰面積比，y為與內標的質量比。

（2）樣品中溶劑的檢測。

發酵液12 000 r/min離心10 min后，取上清液，與內標異丁醇混合后采用氣相色譜儀進樣檢測。色譜柱為KB-5MS，25 m×0.53 mm×1.00 μm；檢測器FID；進樣口溫度240 ℃；檢測器溫度260 ℃；柱溫80 ℃（保溫5 min）～120 ℃（保溫3 min）；進樣量1μL。

1.7.2 pH值的測定

用pH計測定溶液pH值。

2 結果與分析

在單因素實驗基礎上，進行正交實驗，分析結果可知：影響結果的順序，為交聯時間>交聯聯溫度>PVA濃度>戊二醛濃度，最佳配比A2B2C2D3，即PVA濃度為7%，戊二醛濃度為2%，交聯時間4 h，交聯溫度37 ℃，此時丁醇產量可達11.72 g/L，總溶劑產量最高可達12.51 g/L。

3 結語

（1）單因素實驗結果表明，PVA為7%，海藻酸鈉2%，戊二醛2%，固定化交聯時間4 h，固定化交聯溫度37 ℃時，丁醇和總溶劑產量較高。

（2）正交實驗的確定了固定化交聯條件：PVA濃度為7%，戊二醛濃度為2%，交聯時間4h，交聯溫度37 ℃，此時丁醇產量可達11.72 g/L，總溶劑產量最高可達21.51 g/L。

（3）由于時間的原因未對固定化條件、固定化小球特性、固定化小球的回收利用等進行詳細研究，需要在以后的工作中多查閱文獻合理安排時間。

參考文獻

[1] 肖美燕，徐爾尼，陳志文.包埋法固定化細胞技術的研究進展[J].食品科學，2003，24（4）：158-161.

[2] 蔣宇紅，黃霞，俞毓馨.幾種固定化細胞載體的比較[J].環境科學，1993，14（2）：11-15.

[3] 張磊，張燁，侯紅萍.固定化細胞技術的研究進展[J].四川食品與發酵，2006（1）：5-7.

[4] Chen BY.Revealing threshold criteria of biostimulation fordye-laden wastewater treatment using immobilized cell sys—tems[J].Process Biochem.，2007（42）：158-166.