“PCR技術(shù)原理和應(yīng)用”考點(diǎn)的復(fù)習(xí)建議

王銳利

1 理解PCR技術(shù)的基本原理及過(guò)程，能夠區(qū)分PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的異同

PCR的循環(huán)過(guò)程分為三部分：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成。圖1為大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制示意圖，與PCR技術(shù)相比，二者所用引物在化學(xué)本質(zhì)上的區(qū)別是什么？圖中所示的子代DNA中最終不含堿基U，其原因是什么？

如圖，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程具備了邊解旋邊復(fù)制的特點(diǎn)以及半保留復(fù)制的方式。而且其中一條子鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成，而另一條子鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的，于是就形成了岡崎片段。胞內(nèi)RNA引物完成延伸后，被RNA酶水解所形成的缺口再通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái)。PCR過(guò)程和胞內(nèi)DNA復(fù)制的異同點(diǎn)見(jiàn)表1。

2 PCR過(guò)程中引物設(shè)計(jì)的相關(guān)問(wèn)題

引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。引物設(shè)計(jì)的原則有：① 引物序列設(shè)計(jì)要依據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)DNA兩端的部分序列，長(zhǎng)度通常為20～30bp，盡量降低引物與非擴(kuò)增區(qū)的同源性；② 引物內(nèi)部不能存在部分互補(bǔ)序列；③ 兩個(gè)引物之間不能存在部分互補(bǔ)序列；④ 引物是從引物的5′向3′方向延伸的，所以引物的5′端可以修飾，但3′端不可以修飾，否則會(huì)阻礙向3′方向的延伸。根據(jù)這些原則，引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題可以從以下幾個(gè)角度進(jìn)行命題。

2.1 引物序列的合理性

【例1】 某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（圖2），請(qǐng)問(wèn)原因分別是什么？

分析與參考答案：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則可知，第一組引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而不能與目的基因上下游的特定序列結(jié)合而失效。第二組引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。

2.2 引物個(gè)數(shù)的問(wèn)題（注意和探針個(gè)數(shù)的問(wèn)題加以區(qū)別）

【例2】 一個(gè)目的基因通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增n次時(shí)，總共需要多少個(gè)引物。擴(kuò)增第n次時(shí)，又需要多少個(gè)引物。

分析這種題型可以借助于DNA的半保留復(fù)制模型，可知擴(kuò)增n次，只有最初的DNA的兩條模板鏈不需要引物，其他DNA鏈均需要引物，所以擴(kuò)增n次，共需要引物（2n×2-2）個(gè)，即（2n-1）對(duì)引物。而探針個(gè)數(shù)的問(wèn)題，又不能簡(jiǎn)單的類比引物個(gè)數(shù)的問(wèn)題，如例3。

【例3】 TaqMan探針是qPCR技術(shù)中一種常用探針（圖3），其5′末端連接熒光基團(tuán)（R），3′末端連接淬滅劑（Q）。當(dāng)探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光信號(hào)被Q吸收而不發(fā)熒光。在qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q，R發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢測(cè)到，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步（圖4）。

若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為a，加入的目的基因?yàn)閎個(gè)，請(qǐng)根據(jù)圖示過(guò)程，試用數(shù)學(xué)公式表示反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）與擴(kuò)增次數(shù)（n）之間的關(guān)系是什么。

此問(wèn)對(duì)能力的要求比較高，解答此題要明確兩點(diǎn)：① 1個(gè)TaqMan探針只與DNA的一條鏈結(jié)合（注意有別于1對(duì)引物和DNA兩條模板鏈結(jié)合），1個(gè)目的基因擴(kuò)增1次，Rn=a，2個(gè)目的基因擴(kuò)增1次，Rn=2a，4個(gè)目的基因擴(kuò)增1次，Rn=4a。② 熒光強(qiáng)度會(huì)累積，即疊加下去。以1個(gè)目的基因擴(kuò)增為例：擴(kuò)增1次，Rn=a；擴(kuò)增2次，Rn=a+2a；擴(kuò)增3次，Rn=a+2a+4a；擴(kuò)增4次，Rn=a+2a+4a+8a；如此擴(kuò)增n次，Rn=a+2a+22a+23a+…+2n-a=（2n-1）a，所以加入目的基因?yàn)閎個(gè)，Rn=ab×（2n-1）。所以，審題時(shí)要注意引物和探針與DNA結(jié)合的區(qū)別。

2.3 定點(diǎn)突變技術(shù)與引物設(shè)計(jì)

定點(diǎn)突變技術(shù)是指通過(guò)PCR技術(shù)向目的基因片段中引入所需變化。比如，GFP（綠色熒光蛋白）的發(fā)光基團(tuán)是第65～67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸），該發(fā)光基團(tuán)可利用定點(diǎn)突變技術(shù)使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可成為藍(lán)色熒光蛋白（圖5）。

定點(diǎn)突變第一步得把突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物上，如圖5所示第66位酪氨酸（UAC）換成組氨酸（CAC），可以推導(dǎo)出相應(yīng)的基因堿基序列由ATG突變?yōu)镚TG。因此人工合成短DNA引物應(yīng)包含的序列為AGAGTGCTC。由于突變位點(diǎn)的堿基不能夠與模板鏈互不配對(duì)，所以突變位點(diǎn)一般設(shè)計(jì)在引物的中間位置，從而確保突變位點(diǎn)兩側(cè)的序列能夠互不配對(duì)，同時(shí)還不妨礙3′的延伸，這樣錯(cuò)配引物仍能引導(dǎo)完成DNA復(fù)制。最后，通過(guò)觀察熒光蛋白是否發(fā)出藍(lán)色光來(lái)檢驗(yàn)該定點(diǎn)突變技術(shù)是否成功。

3 PCR結(jié)果的檢測(cè)相關(guān)問(wèn)題分析

3.1 PCR結(jié)果與遺傳題

人類的甲型血友病為伴X隱性遺傳疾病，致病基因用字母h表示；粘多糖病、葡萄糖-6磷酸脫氫酶缺乏癥（俗稱蠶豆黃）均為單基因遺傳病，分別有A-a基因及E-e基因控制。圖6為甲、乙家族通婚的遺傳系譜圖，通婚前，甲家族不具有粘多糖致病基因，乙家族不具有蠶豆黃致病基因，且Ⅰ-2不具蠶豆黃致病基因。

【例4】 根據(jù)條件可以推知圖譜中，圖譜中蠶豆黃病為伴X染色體隱形遺傳病，粘多糖病為常染色體隱性遺傳病。為了探明Ⅳ-2的病因，醫(yī)院對(duì)上述遺傳系譜圖中的Ⅲ、Ⅳ代成員的該等位基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，電泳的結(jié)果如圖7所示。根據(jù)電泳結(jié)果與遺傳系譜圖，推論Ⅳ-2的無(wú)血友病XXY癥的形成原因是什么。

根據(jù)原題目中已有的條件，可以判斷電泳結(jié)果為2.45 kb是隱性基因，2.5 kb是顯性基因，所以Ⅲ-3的基因型為XHXh。由于Ⅳ-2的細(xì)胞中無(wú)隱形基因，所以XXY癥形成的原因是Ⅲ-3個(gè)體減數(shù)第二次分裂姐妹染色單體分離后沒(méi)有分開(kāi)進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞中，而是進(jìn)入了同一個(gè)卵細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致了XXY個(gè)體的出現(xiàn)。

3.2 PCR異常結(jié)果的分析

【例5】 電泳可以直觀對(duì)比DNA的完整性，分子大小不同的DNA在凝膠上遷移速率不同，從而產(chǎn)生不同的條帶。圖8是上述實(shí)驗(yàn)中提取到的總DNA凝膠電泳結(jié)果，其中M是已知大小的不同DNA的混合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A、B方法提取的總DNA電泳結(jié)果只有一條帶，而C方法有明顯的“拖尾”現(xiàn)象。① 只出現(xiàn)一條帶的原因是什么？② 出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象的原因是什么？

生物總DNA有多種DNA分子，只形成一條帶說(shuō)明完整DNA分子的分子量大，不易分離；若DNA分子發(fā)生斷裂或降解，生成較多不同大小的相對(duì)較小的DNA分子，電泳時(shí)略有分離但又不充分，即出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象。所以答案為：① 甜菜細(xì)胞基因組DNA分子都比較大，不容易分離；② DNA發(fā)生斷裂或降解，形成許多大小不等的DNA片段。

4 小結(jié)

PCR技術(shù)是當(dāng)今世界各國(guó)分子生物學(xué)研究的重要手段。其內(nèi)容本身就很抽象，原理更是高中生目前認(rèn)知水平所難以把握的。高考考綱將其納為一個(gè)單獨(dú)考點(diǎn)，旨在為高中生進(jìn)入大學(xué)后能夠快速向科研型人才轉(zhuǎn)變做足鋪墊，教師要引起重視。通過(guò)一輪復(fù)習(xí)，學(xué)生對(duì)PCR基本的生物學(xué)知識(shí)點(diǎn)均已重溫了一遍，初步掌握了相關(guān)知識(shí)之間的關(guān)聯(lián)，但由于學(xué)生的認(rèn)知水平和能力有限，還不能準(zhǔn)確地將零散但又有內(nèi)在聯(lián)系的知識(shí)點(diǎn)整合成塊。

在此基礎(chǔ)上，教師可以通過(guò)示意圖形象深入地展示了PCR技術(shù)的原理和過(guò)程、通過(guò)羅列PCR引物方面的若干問(wèn)題介紹了這一塊考查的題型、通過(guò)對(duì)PCR結(jié)果的深入分析，讓學(xué)生很好地掌握了PCR原理和PCR操作過(guò)程中的注意事項(xiàng)。這樣，二輪復(fù)習(xí)的目標(biāo)也就水到渠成了：① 要從全面基礎(chǔ)復(fù)習(xí)轉(zhuǎn)入重點(diǎn)復(fù)習(xí)，對(duì)各重點(diǎn)、難點(diǎn)進(jìn)行提煉和訓(xùn)練；② 將一輪復(fù)習(xí)過(guò)的基礎(chǔ)知識(shí)運(yùn)用到實(shí)戰(zhàn)考題中去，將已經(jīng)掌握的知識(shí)轉(zhuǎn)化為實(shí)際解題能力；③ 把握高考各題型的特點(diǎn)和規(guī)律，掌握解題方法，形成應(yīng)試技巧。