“基因敲除”專題探析

1 基因敲除概述

基因敲除自20世紀80年代末發展起來，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎干細胞技術基礎上的一種定點修飾基因組的新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術，其與體細胞核移植技術的成功結合，已經成為一種有效的定點修飾、改造大動物基因組DNA片段的實驗策略。或者說基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾、改造染色體上某一基因的目的的一種技術。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。20世紀80年代初，胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養試驗的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。1987年，Thompson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術得到了進一步的發展和完善。

簡單的說，基因敲除是指將目標基因從基因組中刪除。比如，有一段“序列”：“1234567890”（原基因），敲除后為“1237890”，一般一個敲除載體還會在其中插入一段外源基因，如“ABC”，則新的基因為“123ABC7890”，或者不插入基因直接連接，則為“1237890”。

通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被應用，比較成功的有基因的插入突變和RNAi，它們同樣可以達到基因敲除的目的。在基因敲除技術中涉及到的變異類型有基因重組、基因突變、人工誘變。

2 相關試題評析

2.1 考查基因敲除的基本原理

【例1】 基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，將同源DNA片段導入受體細胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段，達到基因敲除的目的。由此可推測（ ）

A. 基因敲除實際上是刪除某個基因，達到使該基因“沉默”的目的

B. 利用基因敲除技術不能修復細胞中的病變基因

C. 基因敲除可定向改變生物體的某一基因

D. 基因敲除技術可治療先天性愚型

評析：由題意可知基因敲除實際上是替換了某個基因片段，從而達到使該基因“沉默”的目的，A選項錯誤。基因敲除既可以是敲除相應的正常基因，也可以敲除相應的突變基因，可定向改變生物體的某一基因，B選項錯誤，選項C正確。先天性愚型是染色體異常引起的遺傳病，多了一條染色體，不能用基因敲除治療，D選項錯誤。

參考答案：C。

【例2】 基因敲除是根據DNA重組原理發展起來的一門新興技術。通常用設計好的DNA片段替代動物細胞內的基因片段，從而達到基因敲除的目的。運用基因敲除技術構建基因敲除動物模型是研究基因功能中較為普遍的一種方法，其基本原理如圖1所示。

請回答下列問題：

（1） 在將目的基因導入受體細胞前，需要構建一個基因表達載體。一個理想的基因表達載體，通常由啟動子、終止子、目的基因和 等四部分組成。在此過程中，所需使用的相關工具酶是 。

（2） 如果要獲得一只含目的基因的小鼠，則選擇的受體細胞通常為 ，基因導入該細胞時，可以采用 等方法。

（3） 上述途徑所獲得的動物，其后代并非每一個個體都含目的基因，原因是 。

（4） 假設通過基因敲除構建了一個非球形紅細胞性貧血（Ⅱ型）模型動物，該動物因丙酮酸激酶缺陷或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷，使紅細胞膜變化引起紅細胞自溶現象，但若向該動物注射ATP后，自溶現象可明顯降低。由此可表明，基因對生物性狀的控制方式之一是： 。

（5） 某實驗小組向正常小鼠胚胎細胞內導入某“X基因”后，發現靶基因能正常轉錄形成mRNA，但細胞內卻不再合成相應蛋白質，其原因最可能是

。

評析：通過圖示，可分析出基因敲除的基本原理：應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。

（1） 基因表達載體由啟動子、終止子、目的基因和標記基因四部分組成，在構建基因表達載體過程中，需使用到限制性核酸內切酶和DNA連接酶。

（2） 培育轉基因動物時，選擇的受體細胞通常為受精卵，通過采用顯微注射法將基因表達載體導入受精卵中。

（3） 轉基因動物是雜合子，在產生后代時等位基因分離，所以后代并非每一個個體都含有目的基因。

（4） 該動物由于酶異常導致紅細胞自溶，說明基因通過控制酶的合成來控制代謝過程，進而控制生物性狀。

（5） 靶基因能正常轉錄形成mRNA，但不能合成蛋白質。很顯然是翻譯過程不能進行，究其原因是“X基因”轉錄形成的mRNA與靶基因轉錄形成的mRNA雜交，來阻斷蛋白質的合成。

參考答案：（1） 標記基因 限制性核酸內切酶（限制酶）、DNA連接酶 （2） 受精卵 顯微注射法（或病毒感染法） （3） 轉基因動物為雜合子，在形成生殖細胞時等位基因發生分離 （4） 基因通過控制酶的合成來控制代謝過程，進而控制生物性狀 （5） “X基因”轉錄形成的mRNA與靶基因控制合成的mRNA雜交，抑制其控制合成酶（蛋白質）的過程（或抑制了目的基因的翻譯過程）

2.2 考查CRISPR/Cas9基因定點修飾

【例3】 （2016·江蘇高考） 近年誕生的具有劃時代意義的CRISPR/Cas9基因編輯技術可簡單、準確地進行基因定點編輯。其原理是由一條單鏈向導RNA引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割（圖2）。下列相關敘述錯誤的是（ ）

A. Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成

B. 向導RNA中的雙鏈區遵循堿基配對原則

C. 向導RNA可在逆轉錄酶催化下合成

D. 若α鏈剪切點附近序列為……TCCACAATC……則相應的識別序列為……UCCACAAUC……

評析：此題是對基因編輯技術的考查，在一個全新的學科前沿新情境下，設置了與核心知識點“蛋白質合成”“核酸堿基配對原則”“中心法則”相關的考點，考查學生運用學科知識解決問題的能力。解答本題的關鍵在于結合圖示理解基因編輯技術的操作過程，圖中向導RNA為雙鏈RNA，與DNA相似，含有氫鍵，兩條鏈間遵循堿基互補配對原則；同時理解DNA和RNA在堿基上的區別，前者含T，后者含U，均能與A互補配對，另外理解逆轉錄過程也是解答本題的關鍵，以RNA為模板合成DNA。

提供新情境，以最新的科學進展和實驗素材為背景進行命題，學生在收集信息的同時，要能與已掌握的相關知識內容相聯系，準確處理信息。如上題C選項中提到逆轉錄酶，要能迅速想到那是以RNA為模板催化合成DNA的。

參考答案：C。

【例4】 豬的肌肉生長抑制素（MSTN）基因可抑制肌細胞的增殖和分化。CRISPR/Cas9是一種最新出現的基因編輯技術，其主要過程是向導RNA（gRNA，含與目的基因部分序列配對的單鏈區）與Cas9核酸酶結合，引導Cas9核酸酶對DNA局部解旋并進行定點切割。科研人員利用該技術定向敲除豬胎兒成纖維細胞中MSTN基因，以期獲得生長速度快、瘦肉率高的新品種，過程如圖3所示，其中BsmB I、Kpn I、EcoR I表示相應限制酶的識別位點。分析回答：

（1） 圖中①過程用到的工具酶有 ，圖中gRNA基因序列設計的主要依據是 。

（2） 科研人員可利用 （方法）將重組質粒導入豬成纖維細胞，經 過程合成Cas9核酸酶。

（3） 過程③與DNA復制相比，特有的堿基配對方式有 。

（4） 分析發現某基因敲除細胞株中MSTN基因的表達水平為正常細胞的50%，說明 。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纖維細胞培育成MSTN基因缺失豬，請簡要說出基本的流程。

。

評析：本題考查基因敲除的相關知識。要理清CRISPR/Cas9技術，首先要根據目的基因上兩端的堿基序列設計gRNA基因，接著gRNA基因轉錄出gRNA，Cas9基因轉錄和翻譯出Cas9核酸酶，Cas9核酸酶與gRNA結合后，通過gRNA識別目的基因兩端的堿基序列，Cas9核酸酶具有解旋和剪切目的基因的作用，最后DNA自主修復，從而實現了基因的定點敲除。

（1） 圖中①過程用到的工具酶有BsmB I和DNA連接酶，圖中gRNA基因序列設計的主要依據是MSTN基因兩端核苷酸序列，這樣gRNA才能識別MSTN基因兩端核苷酸序列。

（2） 科研人員可利用顯微注射技術將重組質粒導入豬成纖維細胞，經轉錄和翻譯過程合成Cas9核酸酶。

（3） 過程③為RNA與DNA配對，與DNA復制相比，特有的堿基配對方式有U-A。

（4） 分析發現某基因敲除細胞株中MSTN基因的表達水平為正常細胞的50%，說明細胞中位于一對染色體上的兩個MSTN基因中僅有一個被敲除，還有一個MSTN基因正常表達。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纖維細胞培育成MSTN基因缺失豬，可利用MSTN基因缺失成纖維細胞的核移植到去除核的卵母細胞中，早期胚胎培養獲得胚胎，再經胚胎移植可培養獲得MSTN基因缺失豬。

參考答案：（1） BsmB I和DNA連接酶 MSTN基因兩端核苷酸序列 （2） 顯微注射技術 轉錄和翻譯 （3） U-A （4） 細胞中位于一對染色體上的兩個MSTN基因中僅有一個被敲除 （5） 利用MSTN基因缺失成纖維細胞的核移植到去除核的卵母細胞中，早期胚胎培養獲得胚胎，胚胎移植培養獲得MSTN基因缺失豬

2.3 考查基因敲除在基因工程中的應用

【例5】 利用“基因敲除”技術，能“敲除”DNA上的特定基因。該技術的主要過程如圖4所示。

（1） 胚胎干細胞可從小白鼠的 中分離得到。

（2） neoR基因插入靶基因使用的工具酶是

和 ，前者識別特定脫氧核苷酸序列并在特定位點切開。“靶基因失活”的含義是

。

（3） 失活靶基因與正常靶基因互換涉及的變異類型是 ；處理后的胚胎干細胞，轉移到特定培養基中篩選培養。“特定培養基”中需加入 以能起到篩選培養的目的。

（4） 科學家可以通過“基因敲除”來研究基因的功能，培養圖示中胚胎干細胞所獲得的“基因敲除”小白鼠 （填“能”或“不能”）直接用于研究基因功能，原因是 。

評析：本題考查基因敲除、基因工程的相關知識，意在考查考生能理解所學知識的要點，把握知識間的內在聯系，形成知識網絡結構的能力。同時要求考生能夠在不同情境下綜合利用所學知識和技能處理復雜任務，具有扎實的學科觀念和寬闊的學科視野，并體現出自身的實踐能力、創新精神等內化的綜合學科素養。

（1） 胚胎干細胞可以從早期胚胎或原始性腺中分離得到。

（2） 基因工程用到的工具酶包括限制酶和DNA連接酶；基因是控制生物性狀的基本單位，當neoR基因插入靶基因后將導致靶基因的結構被破壞，失去原有的結構和功能，結果靶基因失活而不能表達。

（3） 從圖解中可以看出，失活靶基因與正常靶基因是同源互換，故兩者互換片段屬于基因重組；因為neoR基因是新霉素抗性基因，經處理后的胚胎干細胞獲得了neoR基因，所以能在含新霉素的培養基上生存，而未經處理的胚胎干細胞在此培養基上無法生存，故“特定培養基”中需加入新霉素才能起到選擇作用。

（4） 培養圖示中胚胎干細胞所獲得的“基因敲除”小白鼠不能直接用于研究基因功能，因為該小白鼠體內仍有一個正常的靶基因，也可能表達性狀。

參考答案：（1） 早期胚胎或原始性腺 （2） 限制性核酸內切酶（或限制酶） DNA連接酶 靶基因中的脫氧核苷酸序列發生改變，不能表達 （3） 基因重組 新霉素 （4） 不能 因為該小白鼠體內仍有一個正常的靶基因，也可能表達性狀

參考文獻：

[1] 呂飛.淺談“基因敲除”[J].生物學教學，2010.35（10）：61-62.

[2] 張卓鵬.22016年江蘇生物學高考題“五性”考查[J].生物學教學，2017.42（1）：54-56.