雌激素及其受體1在先兆子癇患者中的研究

楊 洋，張少華，陳 蕊，韓 彬

雌激素及其受體1在先兆子癇患者中的研究

楊 洋，張少華，陳 蕊，韓 彬

目的通過研究雌激素受體1(estrogen receptor 1，ER1)在先兆子癇(preeclampsia，PE)和正常胎盤組織中信使RNA(messenger RNA，mRNA)及蛋白水平表達(dá)，并結(jié)合PE孕婦和正常孕婦血漿中雌激素水平探討雌激素及ER1與PE的相關(guān)性及其意義。方法采用電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)檢測正常足月孕婦(對照組，n＝20)和PE孕婦(試驗組，n＝20)血漿中雌激素水平；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡(Western-Blot)技術(shù)檢測對照組和試驗組胎盤組織中ER1在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果試驗組血漿中雌激素水平明顯低于對照組(P＜0.05)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot檢測對照組和試驗組均有ER1表達(dá)，試驗組ER1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論PE病理狀態(tài)下體內(nèi)較低水平的雌激素水平可能導(dǎo)致了ER1的代償性增多；ER1作為雌激素功能實現(xiàn)的核心，可能通過對雌激素的介導(dǎo)作用而參與了PE的發(fā)生、發(fā)展。

雌激素受體1；先兆子癇；雌激素；胎盤組織

先兆子癇(preeclampsia，PE)是一種妊娠期特有的疾病，臨床表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿、水腫，嚴(yán)重時出現(xiàn)抽搐、昏迷，嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的生命健康[1]。其發(fā)病率高，在婦產(chǎn)科臨床工作中較為常見。而導(dǎo)致PE產(chǎn)生的病因諸多，暫無明確定論。胎盤因素及螺旋動脈血管重鑄不足是目前較為一致的看法[2-3]。雌激素作為人體內(nèi)重要的一種類固醇激素，通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)相結(jié)合，發(fā)揮其生理功能。ER分為ER1和ER2的2種亞型[4]，分布于人體中不同的臟器和組織。而主要分布于子宮、胎盤、乳腺經(jīng)典雌激素靶器官的ER1[5]，通過介導(dǎo)雌激素，在胎盤形成、胚胎著床等妊娠生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過血漿激素水平測定、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及免疫印跡(Western-Blot)技術(shù)檢測PE孕婦和正常孕婦血漿中雌激素水平以及ER1在胎盤組織中的表達(dá)，探討雌激素與ER1在PE發(fā)病過程中的可能作用，為臨床探究PE病因提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年12月—2016年5月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的40例產(chǎn)婦。對照組(正常孕婦)選取20例無圍產(chǎn)期并發(fā)癥產(chǎn)婦，年齡(23.6±1.0)歲，孕期(38.2±2.1)周。試驗組選取并發(fā)PE、未接受任何治療產(chǎn)婦20例，年齡(26.3±2.8)歲，孕期(37.1±2.7)周，依據(jù)謝幸、茍文麗主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。2組均選取單胎、初產(chǎn)者，孕期均規(guī)律產(chǎn)檢，未發(fā)現(xiàn)其余特殊圍產(chǎn)期疾病，分娩方式均為剖宮產(chǎn)。2組行均衡性檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

1.2.1.1 血漿樣本采集 2組均于入院后接受藥物治療前采集晨起空腹肘靜脈血2 mL。所有血液樣本均在采集后置于加有抗凝劑的試管中，立即搖勻，3 000 r/min離心5 min后，吸取上層血漿置于2.0 mL EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)錅y。

1.2.1.2 胎盤樣本采集 胎盤娩出后5 min內(nèi)立即于胎盤母體面避開鈣化、出血點及胎兒成分組織，切取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小組織數(shù)塊，無菌鹽水漂洗多次，瀝干水分，標(biāo)志后置入液氮罐保存，次日移置于-80℃冰箱，備用。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 血漿雌激素測定 將-80℃冰箱中凍存的待測血漿樣本置于室溫條件下完全溶解，各取200μL，稀釋液50倍稀釋，按照羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)(德國Roche公司)配套檢測試劑盒說明步驟上樣并進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 RT-PCR檢測 RNA提取：取冰凍組織100 mg置于液氮中研磨至粉末狀，按RNAisoTMPlus試劑盒(日本TaKaRa公司)說明步驟，提取樣本RNA。RNA樣本經(jīng)過紫外分光光度儀定量并檢測其特異性，紫外分光光度計測定260 nm和280 nm光密度(optical density，OD)值讀數(shù)的比值(OD260/ OD280)均在1.8～2.0之間，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA完整性后，置于-80℃冰箱儲存。

根據(jù)Genebank中公布的ER1基因序列(基因編號：NM00125)，使用Primerprimer 5.0軟件設(shè)計引物，擴(kuò)增產(chǎn)物100 bp。內(nèi)參選用β-actin，該引物序列參照文獻(xiàn)[6]中具體序列合成，擴(kuò)增產(chǎn)物396 bp，引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照日本 TaKaRa公司的 Prime-ScriptTMRTreagent Kit操作步驟進(jìn)行，總反應(yīng)體系為10μL，反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s。PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)及退火溫度見表1。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在Alphamager 2200凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)中掃描成像，并記錄各特異性DNA擴(kuò)增帶。以目的基因的灰度值與ER1、β-actin的灰度值的比值作為該樣本中ER1信使RNA(messenger RNA，mRNA)的相對表達(dá)量，以此比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及退火溫度

1.2.2.3 Western-Blot檢測 胎盤蛋白提取，用滅菌剪刀剪取100 mg左右的胎盤組織，磷酸鹽緩沖液漂洗后，將組織剪碎，并與1∶100的細(xì)胞裂解液和苯甲基磺酰氟混合液充分研磨；研磨液離心后吸取上清液，按二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒說明書(北京原平皓生物科技有限公司)進(jìn)行蛋白定量。

根據(jù)目的蛋白ER1和β-actin蛋白相對分子質(zhì)量分別為51×103和42×103，使用Western-Blot配膠試劑盒配制10%分離膠和4%濃縮膠；蛋白樣品變

性后上樣并電泳，濃縮膠60 V恒壓、25 min，分離膠160 V恒壓、50min；轉(zhuǎn)膜后，聚偏二氟乙烯膜麗春紅染色，隨即進(jìn)行免疫反應(yīng)；一抗、二抗(英國Abcam公司)孵育反應(yīng)后，化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。用Alphamager 2200凝膠圖像成像系統(tǒng)以X線掃描成像，以目的蛋白的灰度值與ER1、β-actin的灰度值的比值作為該樣本中ER1 mRNA的相對表達(dá)量，以此比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿雌激素測定 試驗組的血漿雌激素水平(30.208±13.547)ng/mL較對照組(52.115±19.572) ng/mL明顯低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝6.049，P＜0.05，圖1)。

圖1 2組血漿雌激素水平

2.2 RT-PCR檢測 對照組和試驗組均有ER1表達(dá)，試驗組 ER1表達(dá)高于對照組(圖 2)；試驗組ER1在mRNA水平的表達(dá)(0.43±0.1)高于對照組(0.21±0.07)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝-13.979，P＜0.05，圖3)。

2.3 Western-Blot檢測 對照組和試驗組蛋白水平均有ER1表達(dá)(圖4)，試驗組ER1在蛋白水平表達(dá)(0.99±0.01)高于對照組(0.63±0.06)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝-23.702，P＜0.05，圖5)。

圖2 2組ER1 RT-PCR檢測

圖3 2組ER1 mRNA水平表達(dá)

圖4 2組ER1蛋白水平的Western-Blot檢測

圖5 2組ER1蛋白水平表達(dá)

3 討論

雌激素作為一種類固醇激素，在人體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)活性。其通過擴(kuò)散到靶器官以發(fā)揮相關(guān)作用。雌激素對細(xì)胞的特定作用，除與其本身分子結(jié)構(gòu)有關(guān)之外，主要是通過配體激活轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)反應(yīng)，稱作ER。ER1和ER2是ER 2種亞型，共同介導(dǎo)雌激素和雌激素樣作用而發(fā)揮生物效用[7]。ER1和ER2在全身各個組織中均有分布，子宮等生殖器官中以ER1為主[8]。此外，諸多研究也發(fā)現(xiàn)ER1分布于人血管平滑肌細(xì)胞。ER的特異性分布是它們發(fā)揮不同生物學(xué)作用的組織基礎(chǔ)[9]。

胎盤作為妊娠期機(jī)體的特殊器官，合成和分泌多種激素，其中在妊娠晚期以雌激素的分泌量最多。同時，胎盤本身也作為雌激素的靶器官參與整個妊娠過程。PE時，胎盤淺著床，繼發(fā)胎盤缺血、缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致全身小動脈痙攣及PE發(fā)生。雌激素可與孕激素協(xié)同作用，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞水解酶釋放，使胚泡的透明帶溶解而有助于著床；也可能影響子宮上皮細(xì)胞或使上皮細(xì)胞自體溶解，有利于滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜[10]。雌激素正是通過ER1介導(dǎo)發(fā)揮其諸多生物學(xué)效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PE孕婦血漿中雌激素水平低于正常孕婦(P＜0.05)；RT-PCR及Western-Blot檢測顯示mRNA和蛋白水平ER1在試驗組表達(dá)高于對照組(P＜0.05)。雌激素在妊娠期內(nèi)通過發(fā)揮其相關(guān)活性參與整個妊娠過程。而人體內(nèi)總雌激素活性則包含外源性雌激素即環(huán)境雌激素和內(nèi)源性雌激素活性物質(zhì)雌二醇(estradiol，E2)的活性總和[11]。環(huán)境雌激素通過與E2競爭靶器官的ER、模擬及阻斷內(nèi)源性雌激素、刺激并抑制雌激素的生物效應(yīng)等方式，來干擾其合成、轉(zhuǎn)運及清除等過程，使E2不能發(fā)揮正常效應(yīng)，進(jìn)而對人體健康造成危害[12-13]。曹新國等[14]采用ER介導(dǎo)的報告基因方法，發(fā)現(xiàn)PE患者血清中環(huán)境雌激素的含量大于正常孕婦。Kashiwagi等[15]發(fā)現(xiàn)E2在妊娠高血壓綜合征患者血清中含量明顯低于正常孕婦組。由此推測，PE孕婦體內(nèi)的低雌激素水平引起胎盤組織中ER1代償性增多，而PE胎盤中由于存在病理性表達(dá)的ER1，進(jìn)一步加重PE孕婦體內(nèi)雌激素水平不足，引起母體全身小動脈和胎盤螺旋動脈舒張減退、血液高凝狀態(tài)、一氧化氮水平下降；此外，PE異常表達(dá)的ER1介導(dǎo)的低雌激素環(huán)境可能干擾滋養(yǎng)細(xì)胞腺苷A2BR通路[16]，進(jìn)而影響細(xì)胞侵襲，最終引發(fā)胎盤淺著床，PE發(fā)生。此外，前期研究中免疫組織化學(xué)實驗定位發(fā)現(xiàn)，PE孕婦胎盤組織中ER1在滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的陽性表達(dá)率高于正常孕婦[17]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步印證了前期發(fā)現(xiàn)。

PE病理狀態(tài)下體內(nèi)較低水平的雌激素可能導(dǎo)致了ER1的代償性增多；ER1作為雌激素功能實現(xiàn)的核心，可能通過對雌激素的介導(dǎo)作用而參與了PE的發(fā)生、發(fā)展。本研究為深入探究PE疾病提供了一定的理論和研究基礎(chǔ)。

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Investigation on the expression of estrogen and estrogen receptor 1 in preeclam psia patients

YANG Yang1，ZHANG Shaohua1，CHEN Rui1，HAN Bin2
(1.Department of Gynecology，the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University，Shaanxi Xi’an 710077，China；2.Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University，Shaanxi Xi’an 710077，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between estrogen receptor 1(ER1)and preeclampsia(PE)and the significance by comparison of expression of ER1 messenger RNA (mRNA)and protein in placenta and plasma levels of estrogen of pregnantwomen with PE and the normal pregnant women.MethodsTo detect plasma levels of estrogen of group in normal term pregnantwomen(control group，n＝20)and the group of pregnant women with PE(experimental group，n＝20)by using automatic electro-chemiluminescence immunoassay system.To detect expression of ER1 mRNA and protein in placenta of 20 pregnantwomen with PE and 20 normal pregnantwomen by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western-Blot.ResultsThe plasma estrogen levels of pregnantwomen were significantly lower than those in the group of normal pregnantwomen with PE(P＜0.05).The results of the RT-PCR and Western-Blot showed that both of the two groups expressed ER1，but the expression of ER1 on themRNA and protein level of the group of pregnant women with PE were higher than that in the group of normal pregnant women(P＜0.05).ConclusionThe higher expression ofmRNA of ER1 in the group of pregnant women with PEmay be related to the lower plasma levels of estrogen in the group of normal pregnant women.As the core for estrogen to play its function，ER1may be involved in the occurrence and development of PE.

Estrogen receptor 1(ER1)；Preeclampsia(PE)；Estrogen；Placental

R714.245

B

2095-3097(2017)04-0217-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.04.006

2017-02-27 本文編輯：徐海琴)

陜西省科技計劃項目(S2016YFSF0367)

710077陜西西安，西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科(楊 洋，張少華，陳 蕊)，麻醉科(韓 彬)

韓 彬，E-mail：38598383＠qq.com