食管鱗癌微小RNA-223表達臨床意義研究

陳 蕾，鄭靄萱，鄭志偉，李秋麗，翁雪芬

·臨床研究·

食管鱗癌微小RNA-223表達臨床意義研究

陳 蕾，鄭靄萱，鄭志偉，李秋麗，翁雪芬

目的通過檢測食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)患者及健康對照者血清微小RNA-223(microRNA-223，miR-223)的表達來分析其與ESCC診斷、預后之間的相關性。方法以小無編碼RNA U6為內參基因，通過miRNAs提取、反轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應等檢測50例ESCC患者(病例組)和50名年齡、性別與之相匹配的健康對照者(對照組)血清中miR-223的表達水平，再參照ESCC患者的臨床病理特征進行統計學分析。結果病例組血清miR-223表達顯著高于對照組(P＜0.001)。在不同淋巴結轉移情況、不同遠處轉移情況及不同臨床分期的患者中，血清miR-223表達差異均有統計學意義(P＜0.01)。結論血清miR-223表達水平與ESCC的發生、轉移及臨床分期密切相關，提示miR-223可能成為一個有效且無創的診斷及判斷ESCC預后的血清生物標志物。

微小RNA-223；食管鱗狀細胞癌；診斷；預后

食管癌是預后較差的惡性腫瘤，中國食管癌患者人數居世界首位。西方國家食管腺癌發病率較高，而發展中國家食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的發病率則明顯高于食管腺癌[1-3]。在我國，潮汕地區也是ESCC發病率及病死率高發地區之一。由于ESCC患者預后較差，早期診斷、早期治療對提高生存率具有極為重要的意義[4-5]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長度為17～25個核苷酸的高度保守非編碼內源性小分子RNA[6]。它們參與了各種調節途徑，包括造血、發育、器官形成、細胞增殖和凋亡、病毒防御、脂肪代謝等[7]。研究顯示，超過50%的miRNAs的編碼基因位于與腫瘤復制過程中的不穩定脆性位點相關的基因區間[8]。它們參與體內絕大部分信號傳導通路，包括許多與腫瘤發生、發展相關的基因表達。這部分miRNAs的調控與染色體的缺失、易位及增加相關，并且通過參與細胞周期、細胞凋亡和轉移來影響腫瘤的進展[9]。miRNAs不僅能夠調節腫瘤相關基因的表達，就其本身也具有癌基因或抑癌基因的特性[10]。有學者[11-15]發現，部分miRNAs的異常表達與多種腫瘤的發生、發展相關，這些研究大部分是通過組織樣本完成的，而現有研究證實成熟的miRNAs能夠穩定地存在于血液中。多項研究表明，miR-223不僅在腫瘤組織中表達失調，而且在某些實體瘤患者包括ESCC患者外周血中也存在異常的表達[16-18]。由此推論，miR-223具有成為ESCC分子診斷新標志物的極大潛力。由于miR-223與ESCC的相關研究較少，而且關于血清miR-223在ESCC的診斷價值尚不明確。因此，以前人研究為基礎，結合潮汕ESCC高發情況，本研究選擇ESCC患者和健康人群的血清樣本，并研究分析miR-223表達在ESCC發生、發展中的作用及臨床意義，以期對ESCC的診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2013年2月—2014年12月在汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院腫瘤內外科就診的患者，由汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院或其他三甲醫院取腫瘤組織行病理活檢，報告確診為ESCC且未接受過治療的50例為病例組，男性38例、女性12例，年齡(57.5±8.02)歲。對照組為50名與病例組性別、年齡、種族相匹配的汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院體檢結果正常的工作人員，男性35名、女性15名，年齡(55.0±5.48)歲，均無嚴重心腦血管疾病、傳染病、遺傳病病史。

1.1.2 入組標準

1.1.2.1 納入標準 ①符合本病診斷標準：均由汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院或其他三甲醫院取病理組織活檢，證實為ESCC；②有相關的影像學、內鏡資料可進行腫瘤分期確定(分期按第7版國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會ESCC腫瘤淋巴結遠處轉移分期)。

1.1.2.2 排除標準 ①不符合上述納入標準者；②研究相關資料(性別、年齡、腫瘤位置、臨床分期、淋巴結轉移及遠處器官轉移情況、家族史、長期煙酒史)不全，影響研究結果者。

所有入選病例均詳細采集性別、年齡、腫瘤位置、臨床分期、淋巴結轉移及遠處器官轉移情況、家族史、長期煙酒史資料。

1.2 方法

1.2.1 血清miRNAs提取 前期收集病例組與對照組血液樣本后析出血清，血清樣本保存在-80℃直至進一步處理。實驗開始后分別經過裂解分離核酸蛋白復合物、氯仿萃取RNA、無水乙醇沉淀去除大分子RNA、漂洗等步驟獲得血清miRNAs[具體步驟參照TIANGEN miRcutemiRNA提取分離試劑盒說明書，天根生化科技(北京)有限公司]。所提取的總miRNAs以1∶50稀釋，使用紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm光密度值。

1.2.2 反轉錄生成互補DNA第一鏈 對所提取的miRNAs 3′末端加上多聚A尾[即Poly(A)]，再使用Oligo(dT)-universal tag通用反轉錄引物對miRNAs進行反轉錄反應，可生成對應的互補DNA(complementary DNA，cDNA)第一鏈[具體步驟見TIANGEN miRcutemiRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，天根生化科技(北京)有限公司]。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應 使用TIANGEN miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]及ABI7500聚合酶鏈反應(polymease chain reaction，PCR)儀(Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR，美國ABI公司)對cDNA進行實時熒光定量PCR擴增及溶解曲線分析，采用20 μL反應體系，以小無編碼RNA U6(small noncode-RNA U6，RNU6B)為內參基因，重復檢測3次后取均值為對應樣本的miR-223及RNU6B的循環閾值。

1.3 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，檢測數據符合正態分布，各組間連續變量方差齊性，2組間數值比較采用獨立樣本t檢驗；多組間數值比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義，統計檢驗均為雙側概率檢驗。

2 結果

2.1 血清 miR-223表達水平 miR-223在病例組血清中表達水平(9.36±3.81)明顯高于對照組(1.18±0.69)，差異有統計學意義(t＝-14.935，P＜0.001)。

2.2 血清中miR-223表達水平與臨床病理特征之間的相關性 血清miR-223表達水平在已發生淋巴結轉移(t＝-2.882、P＝0.006)及遠處器官轉移(t＝-4.752、P＝0.000)的病例組中顯著上調。不同臨床分期的患者miR-223表達水平差異有統計學意義(t＝-3.967、P＝0.007)，miR-223表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤位置、家族史、煙酒史等無明顯相關性(P＞0.05)。見表1。

表1 ESCC患者血清miR-223表達與臨床病理特征之間的相關性

3 討論

人類基因組的非蛋白質編碼區實際上組成了極為復雜的RNA基因調控網絡，miRNAs是其中備受關注的一員。每個miRNA可以調控約100個靶基因，影響每一個遺傳途徑，參與每一個生命的重要進程。在腫瘤發生、發展過程中，它們可能扮演著原癌基因或抑癌基因的角色，調控著腫瘤的分化與侵襲。食管癌變是許多因素綜合作用的結果，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活。miRNAs作為近期的研究熱點，被認為是高效的基因表達調控因子，參與腫瘤的發生與發展。

miR-223與腫瘤的相關研究較少。有研究者[19]檢測了194例ESCC患者的腫瘤組織以及配對的癌旁組織中miR-223的表達情況，發現與癌旁組織相比，鱗癌組織中miR-223表達顯著上調(P＜0.05)。miR-223不僅在腫瘤組織中表達失調，在某些實體瘤患者外周血中也存在同樣的表達失調：Chang等[20]發現，在結直腸癌患者糞便及血液樣本中miR-223過表達；Zhou等[21]也發現在胃癌患者血清中，miR-223的表達水平較健康對照者顯著升高；類似地，Wu等[22]使用TaqMan低密度芯片檢測了28例ESCC患者和28名健康對照者共754組血清miRNAs的表達，其中發現血清miR-223在ESCC患者中較對照組也顯著升高(P＜0.001)。本研究中，病例組血清miR-223表達也明顯高于對照組(P＜0.001)，與上述相關研究結果相符。以上研究結果均表明，miR-223具有成為ESCC分子診斷標志物的可能性。Kurashige等[23]證明了在ESCC患者中，腫瘤組織miR-223高表達者預后較差，并且是通過抑制相關的腫瘤抑制基因的功能表達進行的。本研究也得出了與上述研究相類似的結果，血清miR-223的表達水平與ESCC患者淋巴結轉移及遠處器官轉移明顯相關：ESCC伴遠處器官轉移的患者，血清miR-223表達水平是無遠處轉移患者的1.5倍(P＜0.001)；而伴淋巴結轉移的患者，miR-223表達水平均為無淋巴結轉移患者的1.6倍(P＜0.01)。此外，不同臨床分期的ESCC患者miR-223的表達水平也呈現出明顯的差異(P＜0.01)。是否存在淋巴結或遠處器官轉移以及臨床分期均與ESCC患者預后息息相關，對于后續治療方案的制定也意義重大。這些結果支持了血清miR-223具有成為ESCC預后生物標志物的極大潛力。或許在以后進一步的試驗中能夠明確表達失調的miRNAs影響腫瘤患者預后的具體途徑，從而了解哪些患者所患腫瘤更具侵襲性，這對腫瘤患者的臨床治療將具有重要的指導意義。miRNAs在食管癌的發生、發展甚至轉移過程中均起著不可小視的作用。隨著許多與發揮miRNA調控作用的通路、表達產物的不斷發現，miRNAs對食管癌的作用機制也將日趨明朗。

本研究顯示，miR-223作為與許多實體瘤發生、發展相關的分子標志物對ESCC的診斷、預后具有重要臨床意義與文獻報道相同[24]。但其具體機制仍有待進一步探討。若血清miRNA檢測技術真正成熟并進入應用，將會成為ESCC患者早期診斷、早期治療及判斷預后的一種簡便、快捷的血清生物標志物診斷手段，值得進一步的研究和期待。

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The diagnostic and prognostic values of serum m icroRNA-223 level in esophageal squamous cell carcinoma

CHEN Lei1，ZHENG Aixuan2，ZHENG Zhiwei1，LIQiuli3，WENG Xuefen1
(1.Internal Medicine Oncology，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515031，China；2.Department of Oncology，Jieyang People’s Hospital，Jieyang Guangdong 522000，China；3.School of Medicine，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028005，China)

ObjectiveTo explore diagnostic and prognostic values of serum microRNA-223 (miR-223)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)by detecting its serum level in patients with ESCC as compared to healthy controls.MethodsMicroRNAs(miRNAs)extraction，reverse transcription and real-time quantitative polymease chain reaction were used to determine the expression levels ofmiR-223，with small noncode RNA U6 used as internal reference gene，in serum specimens from 50 ESCC patients，aswell as 50 age-and gender-matched healthy controls.The association between serum miR-223 level and clinicopathological features was also analyzed.Results

Serum miR-223 levelwas significantly higher in ESCC patients as compared to paired healthy controls(P＜0.001).The level ofmiR-223 was significantly statistically associated with lymph node status，distantmetastasis and clinical stages in ESCC patients，respectively(P＜0.01).ConclusionThe expression ofmiR-223 in serum is closely associated with the carcinogenesis，metastasis and clinical stages of ESCC，suggesting thatmiR-223might serve as a valid non-invasive serum biomarker for the diagnosis and prognosis of patientswith ESCC.

MicroRNA-223；Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)；Diagnosis；Prognosis

R735.1；R342.2

B

2095-3097(2017)04-0213-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.04.005

2017-04-17 本文編輯：徐海琴)

汕頭市科技計劃重點項目基金資助(汕市財教[2013]244號)

515031廣東汕頭，汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院腫瘤內科(陳 蕾，鄭志偉，翁雪芬)；522000廣東揭陽，揭陽市人民醫院腫瘤科(鄭靄萱)；028005內蒙古通遼，內蒙古民族大學醫學院(李秋麗)

陳 蕾，E-mail：lei-chendoc＠163.com