羧甲基茯苓多糖體外抗氧化活性研究

熊芳琪，劉 欣，楊 嵐，彭國(guó)平

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

羧甲基茯苓多糖體外抗氧化活性研究

熊芳琪，劉 欣，楊 嵐，彭國(guó)平

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

目的：比較不同濃度洗脫液洗脫得到的羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性。方法：以茯苓為原料提取茯苓多糖，進(jìn)行羧甲基取代反應(yīng)，分離和純化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4，通過(guò)測(cè)定還原能力、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率比較其體外抗氧化活性。結(jié)果：羧甲基茯苓多糖均表現(xiàn)出與濃度正相關(guān)的體外抗氧化活性，其中CMP-4具有相對(duì)更強(qiáng)的體外抗氧化活性。結(jié)論：所得羧甲基茯苓多糖樣品具有不同的體外抗氧化能力，隨著洗脫液濃度增加，抗氧化活性增強(qiáng)。

茯苓；羧甲基茯苓多糖；抗氧化活性

茯苓作為多孔菌科真菌的干燥菌核，具有利尿、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、保肝等作用[1]， 其主要組成是茯苓多糖，約占干重的90%左右。

本研究采用二次加堿法[2]提取羧甲基茯苓多糖(CMP)，并進(jìn)行分離純化得到不同組分的羧甲基茯苓多糖，采用4種不同的體外抗氧化測(cè)定體系進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，為開發(fā)利用羧甲基茯苓多糖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茯苓菌塊，采自湖南靖州白茯苓。二苯代苦味肼自由基(DPPH)，Sigma 公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、冰醋酸、氯乙酸、過(guò)氧化氫、三氯化鐵、水楊酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀，分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羧甲基茯苓多糖的制備 將茯苓菌塊，粉碎過(guò) 60 目篩備用。精密稱取茯苓粉，加入 20 倍的水，超聲 30 min 后沸水浸提 2 h，過(guò)濾，用 5 倍的 NaOH 堿溶液浸提茯苓渣，置于4 ℃ 處理，抽濾得堿液，加入氯乙酸和 NaOH 溶液，70 ℃ 醚化反應(yīng) 3 h，用乙酸中和至 pH 為7，采用 Sevage 法除去蛋白，活性炭吸附脫色，醇沉，離心，沉淀用水、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚進(jìn)行洗脫，干燥，粉碎，得羧甲基茯苓多糖粉 CMP。

1.2.2 羧甲基茯苓多糖的分離純化[3]取一定量的 CMP 溶于雙蒸水，上樣到已平衡的 DEAE-52 離子交換柱上，用不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，蒽酮硫酸法跟蹤檢測(cè)，根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析，干燥，得到 5 個(gè)羧甲基茯苓多糖純化組分。將得到的 5 個(gè)組分分別溶解，上樣到已平衡的SephadexG-100 葡聚糖凝膠過(guò)濾層析柱，采用氯化鈉溶液洗脫，根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析脫鹽，冷凍干燥，得到羧甲基茯苓多糖均一組分CMP-1、CMP-2、CMP-3和CMP-4，并根據(jù)峰面積計(jì)算各組分多糖含量。

1.2.3 還原能力的測(cè)定[4-6]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，稀釋成不同濃度梯度。向1.0 mL羧甲基茯苓多糖溶液中加入0.2 mL PBS(0.2 mol/L，pH值6.6)和1.5 mL 0.3 % 鐵氰化鉀，搖勻，50 ℃ 恒溫反應(yīng)30 min。加入1.0 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min 離心10 min，取2 mL上清液與0.5 mL 三氯化鐵溶液(0.1%)，再加3 mL 蒸餾水混勻，蒸餾水調(diào)零，在700 nm 處測(cè)定吸光度。溶液吸光度越高，表示還原能力越強(qiáng)。

1.2.4 DPPH自由基清除率測(cè)定[7]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。將2.0 mL的羧甲基茯苓多糖樣品溶液加入到2 mL DPPH 溶液中，混合均勻并在黑暗中反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算公式按式(1)計(jì)算：

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

式(1)中，Ao為水代替樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為乙醇代替DPPH溶液時(shí)的吸光度。

1.2.5 羥基自由基的清除率測(cè)定[8]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。依次加入2.0 mL FeSO4(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL水楊酸(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL樣品溶液，然后加入2.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，37℃水浴后，以蒸餾水為對(duì)照，在510 nm 下測(cè)吸光度。羥基自由基清除率計(jì)算公式按式(2)計(jì)算：

清除率=[A3-(AX-AX0)]/ A3×100%

(2)

式(2)中，A3為不加樣品溶液的吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；Axo是沒(méi)有添加顯色劑時(shí)樣品的吸收值。

1.2.1 不同灌水量對(duì)啤酒大麥生長(zhǎng)的影響測(cè)定 灌水量單因素5水平隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)處理的總灌水量分別為 W1：0 m3/hm2，W2：750 m3/hm2，W3：1500m3/hm2，W4：2250m3/hm2，W5：3000m3/hm2。試驗(yàn)小區(qū)面積10 m2(2.5 m×4 m)，灌水分4次進(jìn)行，如表1所示。條播，行距17 cm，播種深度3～5 cm；撒播先整理好小區(qū)后將種子均勻撒開，然后深犁，耙耱。試驗(yàn)于2017年3月26日種植。

1.2.6 超氧陰離子自由基的清除[9]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。取pH為8.2的Tris- HCl 緩沖液6 mL于比色管中，各自加入0.5 mL樣品溶液，37 ℃ 水浴10 min，然后加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚溶液，混勻，精確處理5 min，立刻用0.5 mL濃鹽酸打斷反應(yīng)，測(cè)320 nm 處吸光值。對(duì)照組以Tris-HCl 緩沖液代替羧甲基茯苓多糖溶液。超氧自由基清除率按式(3)計(jì)算：

清除率=(A4-A5)/A4×100%

(3)

式(3)中：A4為加入樣品溶液后的吸光度；A5為對(duì)照組吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基茯苓多糖分離結(jié)果

用不同濃度的氯化鈉溶液先后，0.05、0.1、0.15、0.2mol/L對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫。由圖1可以得知，經(jīng)過(guò) DEAE-52 纖維素層析柱對(duì)羧甲基茯苓多糖進(jìn)行洗脫分離，主峰位合并得到4個(gè)多糖組分，分別是0.05 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來(lái)CMP-1，占總糖含量的8.47%；0.1 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來(lái)的組分CMP-2，占總糖含量的17.97%；0.15 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來(lái)的組分CMP-3，占總糖含量的13.56%；0.2 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來(lái)的組分CMP-4，占總糖含量的20.00%。洗脫出的多糖含量為總糖含量的60.00 %。從圖1中可看出4個(gè)洗脫峰明顯，說(shuō)明其分離效果好。

2.2 還原能力測(cè)定結(jié)果

根據(jù)抗氧化活性成分的還原能力清除自由基，檢測(cè)吸光度，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。由圖2可知，所有樣品的還原能力與濃度呈正相關(guān)，還原能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.3 DPPH自由基清除率

DPPH自由基可清除其他自由基，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)[10]。由圖3可知，4種樣品對(duì)DPPH自由基的清除率都與濃度呈正相關(guān)，清除能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

圖1 羧甲基化茯苓多糖DEAE-52洗脫曲線

圖2 羧甲基茯苓多糖的還原能力

2.4 羥基自由基清除率

H2O2/Fe2+通過(guò)Fenton 反應(yīng)生成羥自由基，羥自由基能與水楊酸結(jié)合，產(chǎn)生在510nm處強(qiáng)吸收峰物質(zhì)，加入具有清除作用溶液，則會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，使得顯色物質(zhì)減少[11]。由圖4可知，所有樣品對(duì)羥基自由基的清除率與濃度均成正相關(guān)，清除能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.5 超氧陰離子自由基清除率

超氧自由基的清除能力是反應(yīng)藥物抗氧化能力的重要指標(biāo)，在鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩沖液體系下測(cè)定羧甲基茯苓糖清除超氧陰離子的作用，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后，超氧自由基形成其他的氧自由基[12]。由圖5可知，所有樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率與濃度均成正相關(guān)。清除能力在0.6～4.0 mg/mL時(shí)，清除能力較差。當(dāng)樣品濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，CMP-4的清除率明顯高于其他3個(gè)樣，達(dá)到了20.46%。

3 結(jié)論

從茯苓中提取、進(jìn)行羧甲基反應(yīng)、分離和純化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4。利用化學(xué)發(fā)光法評(píng)價(jià)體外抗氧化活性，表明羧甲基茯苓多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除作用，具有較高還原力和抗氧化能力。羧甲基茯苓多糖均表現(xiàn)出在一定濃度范圍內(nèi)與體外抗氧化活性呈正相關(guān)，其中CMP4具有相對(duì)更強(qiáng)的體外抗氧化活性。

圖3 DPPH自由基清除率 圖4 羥基自由基清除率 圖5 超氧陰離子自由基清除率

4 討論

采用不同濃度的NaCl溶液，經(jīng)DEAE-52纖維素層析柱對(duì)羧甲基茯苓多糖進(jìn)行洗脫分離，得到的羧甲基茯苓多糖樣品具有不同的體外抗氧化能力，且隨著洗脫液濃度增加，抗氧化活性增強(qiáng)，其中0.2mol/mL的NaCl溶液洗脫得到的CMP-4抗氧化活性相對(duì)較好。羧甲基茯苓多糖具有較強(qiáng)的還原能力和較好的抗氧化活性，對(duì)羧甲基茯苓多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性間的關(guān)系進(jìn)行研究，將有利于羧甲基茯苓多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Antioxidant Activity of Carboxymethyl-Pachyman

XIONG Fang-qi，LIU Xin，YANG Lan，PENG Guo-ping

(College of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Poriacocos；carboxymethyl-pachyman；antioxidant activity

熊芳琪(1993— )，女，碩士研究生，研究方向：生物活性成分應(yīng)用。

彭國(guó)平(1966— )，男，副教授，研究方向：中草藥開發(fā)與應(yīng)用。