標準曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價

方韻

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215100）

標準曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價

方韻

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215100）

目的：探討用標準曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價。方法：利用標準曲線法測定其效價，與《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規定用抗生素微生物檢定法二劑量法測定其效價進行比較。結果：標準曲線法測定其濃度在3.2～7.81 U/mL范圍內菌圈清晰，標準品所致抑菌直徑平均值的校正值與抗生素濃度對數線性關系良好（r2＝0.998 7）。結論：本法與二劑量法比較，結果無顯著性差異、準確，重復性好。

標準曲線法；抗生素效價；注射用硫酸核糖霉素

硫酸核糖霉素為氨基苷類廣譜抗生素，對革蘭陽性、陰性菌均有抑制作用，對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、大腸桿菌和部分變性桿菌菌株有效，抗菌作用較卡那霉素略弱。本品對綠膿桿菌、結合桿菌無效[1]。由于氨基苷類抗生素無特征紫外吸收[2]，不能直接采用傳統HPLC-UV法測定，《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規定用抗生素微生物檢定法—管碟法（二劑量法[3]）測定其抗生素微生物活性（效價）[4]，本文采用標準曲線法[5-7]測定其效價，效果較好，結果滿意。

1 主要儀器與試劑

1.1 儀器

CAM-IIIB智能型抑菌圈測定儀（上海波浦電腦系統工程有限公司），LMQC-80E立式高壓滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司），E240分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，GNP-9270隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），定量培養皿（直徑90 mm），牛津杯，陶瓦蓋等。

1.2 試劑和藥品

抗生素檢定Ⅰ型培養基（pH 7.8～8.0，批號：130301，來源：中檢院），枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]，核糖霉素標準品（批號：130348-9301，含量：695 U/mg，來源：中檢院），注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941，15092942，15092943，來源：江蘇吳中醫藥集團有限公司蘇州制藥廠）。

2 試驗方法與結果

2.1 緩沖液、菌懸液及雙碟制備

磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）：取磷酸氫二鉀5.59 g與磷酸二氫鉀0.41 g，加水使成1 000 mL，濾過，在115℃滅菌30 min。

菌懸液制備：將枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]的營養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在35～37℃培養7天，用革蘭染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30 min，備用。取適量菌懸液，用滅菌水稀釋至培養基儲備混懸液的比例直到滿意的抑菌區域（中間濃度S3的抑菌直徑約為14～16 mm）。

雙碟制備：取直徑約90 mm，高16～17 mm的平底雙碟，分別注入20 mL加熱融化的抗生素培養基，使碟底內均勻攤布，放置水平臺上使其凝固，作為底層；另取含菌液的培養基5 mL倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固。在每一個雙碟中以等距離均勻放置牛津杯6個，用陶瓦圓蓋覆蓋，備用。

2.2 標準曲線制備

2.2.1 中心濃度的選擇 根據量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，在抗生素項下規定的劑量與反應線性范圍內選擇一個中間濃度S3＝5 U/mL。

2.2.2 標準溶液濃度的確定 依照標準品說明書規定，將標準品溶液按等比級數稀釋。計量間的距離為1∶1.25，算出中間劑量鄰近的高低2個濃度，S3＋1及S3－1，再分別計算各劑量的濃度，各濃度分別為3.20，4.00，5.00，6.25，7.81 U/mL。

2.2.3 標準核糖霉素溶液的制備 精密稱取核糖霉素標準品，用滅菌水制成1 000 U/mL，精密吸取20 mL至200 mL量瓶中，加磷酸緩沖液（pH 7.8）稀釋制成100 U/mL。再分別精密吸取3.20，4.00，5.00，6.25， 7.81 mL至100 mL量瓶中，用pH 7.8磷酸緩沖液稀釋至刻度，制成中間濃度為5 U/mL及Si（i1-i5）各濃度的標準溶液。

2.2.4 標準品測定 取已制備的標準品溶液S1，S2，S3，S4，S5，其中S3為標準品中間濃度5 U/mL，除S3外，將標準品分為1，2，3，4個組，每組3～5個碟子，每個碟子放置6個牛津杯，如圖1所示。在1，2，3，4組的每個碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中分別滴入S1，S2，S4，S5在36～37℃下培養16～18 h，測得每個抑菌圈直徑。

2.2.5 供試品測定 將供試品稀釋成與標準品中間濃度S3一致的濃度U（5 U/mL），如圖2所示。在1，2，3，4組的每個碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中滴入供試品U（5 U/mL）。在36～37℃下培養16～18 h，測得每個抑菌圈直徑。

圖1 各標準品擺放位置

圖2 供試品擺放位置

2.2.6 進行初始計算及變異性的適用性檢查 對于每種濃度的3個碟，分別求出對應的9個中間濃度標準品的平均值XR及各組求得的總平均值P。分別求出S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直徑的9個Si平均值XS，然后求出每3個碟得到的9個數值的標準偏差，進而計算出其相對標準偏差（RSD，該值應不超過10%）[5]，結果見表1和表2。

2.2.7 進行碟間的差異校正 令

可得出4組雙碟的4個反應參數，列于表2（其中XC＝標準品平均值的校正值；XS＝原始的標準品的平均值；XR＝對照值的平均值；P＝校正值）[5]。

2.2.8 建立標準曲線 以標準品所致的抑菌直徑平均值的校正值XC為縱坐標，相應標準品濃度的對數值為橫坐標，進行線性回歸，見表3，得回歸方程：

見圖3。

表1 硫酸核糖霉素標準曲線試驗數據—中間濃度S3所致的抑菌圈直徑平均值XS及P值

表2 硫酸核糖霉素標準曲線試驗數據—S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直徑平均值XR及XC值

表3 標準曲線數據表

圖3 線性回歸結果

3 結果

3.1 供試品效價的測定

與制備中心濃度的標準溶液同法操作制備供試品溶液，供試品溶液的濃度為5 U/mL，在36～37℃下培養16～18 h，測得各抑菌圈的直徑，分別求得供試品溶液抑菌圈直徑的平均值，通過線性方程，計算出供試品所含效價（U/mL），再通過與對照中心濃度比較，得出供試品百分比含量（%）。

本文按此方法測定三批注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941，15092942，15092943），并與二劑量法進行比較，結果見表4。

表4 兩種方法測供試品結果比較

3.2 重現性試驗

取注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941），按本法測定3次，測得值為98.2%，97.6%，99.3%，其平均值為98.3%，相對標準偏差（RSD）為0.88%。

4 討論

管碟法是國內外常用的抗生素檢定法[8]，《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規定的抗生素效價測定法其原理是根據抗生素在一定濃度范圍內，對數劑量與抑菌圈直經（面積）呈線性關系，比較標準品（S）與供試品（T）兩者對接種的特定試驗菌的固體培養基內呈球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區，抑制了試驗菌的繁殖而呈現透明的抑菌圈大小，計算出供試品的效價[3]。因為實驗過程中影響結果的因素較多，任何一個環節操作不當或疏忽就會造成很大誤差，甚至導致整組實驗的失敗[8-9]。

用標準曲線法測定效價與二劑量法相比較，可以減少檢驗過程中的變異性，在數天得到的一系列小的、獨立的綜合含量結果，與相同數量的碟或比色管得出的單一的、大的含量結果比較，其評估的效價更科學。

本文用標準曲線法測定注射用硫酸核糖霉素抗生素效價，選擇標準品中間濃度為5 U/mL，加菌液適量可現直徑在14～16 cm的菌圈，其抑菌圈較邊緣為清晰。而且與二劑量法相比較，結果沒有顯著性差異，實驗過程雖然繁瑣，但結果準確，重現性好。

[1] 吳麗輝.硫酸核糖霉素無菌噴霧工藝的改進[J].福建化工,2005,4(4):25-26.

[2] 王舒,高永良.氨基糖苷類藥物研究新進展[J].解放軍藥學學報,2009,25(4):329-333.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)四部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:160-165.

[4] 國家藥典委員會.衛生部頒藥品標準(抗生素藥品第一冊)[S].1989:89.

[5] The United States Pharmacopeial Convention. Biological Tests/＜81＞ Antibiotics-Microbial Assays USP39-NF34[S].2016:143-161.

[6] 喬曉芳,楊景秀.標準曲線法測定土霉素片的抗生素效價[J].中國醫藥指南,2014,12(35):72-73.

[7] 高嵐,姜鳳麗,秦朝英,等.標準曲線法測定硫酸多粘菌素B的抗生素效價[J].化學分析計量,2009,18(4):80-81.

[8] 蔣惠嵐.管碟法測定抗生素效價的影響因素及控制方法[J].中國獸藥雜志,2011,45(8):53-55.

[9] 胡向東.生物檢定法測定抗生素效價的因素分析[J].黑龍江醫藥,2011,24(1):105.

本文編輯：魯守琴

Determination of Antibiotic Titer of Ribostamycin Sulfate for Injection by Standard Curve Method

Fang Yun
(Suzhou Institute for Drug Control, Jiangsu Suzhou 215100, China)

Objective：To investigate the determination of antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection by standard curve method. Methods：The antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection was determined by standard curve method, and the result was compared with that by 2-dose assay in antibiotics microbial test in Chinese Pharmacopeia (Volume Ⅳ, 2015 edition). Results：Standard curve method showed that the bacterial inhibition rings of the standard at the concentrations of 3.2～7.81 U/mL were clear, while the calibration value of the average diameter of bacterial inhibition rings caused by the standard substance showed a good linear relationship to the logarithm of antibiotic concentrations (r2＝0.998 7). Conclusion：The determination result by standard curve method showed no signifcant difference with that by 2-dose assay, indicating high accuracy and reproducibility of standard curve method.

Standard Curve Method; Antibiotic potency; Ribostamycin Sulfate for Injection

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.015

2017 - 04 - 12

方韻，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品質量檢測與分析。E-mail：32315503@qq.com