AS1411介導STAT3反義寡核苷酸靶向抗腫瘤的作用

劉寶修 黃建勝 朱乃碩

(復旦大學生命科學學院分子感染與免疫實驗室 上海 200438)

AS1411介導STAT3反義寡核苷酸靶向抗腫瘤的作用

劉寶修 黃建勝 朱乃碩△

(復旦大學生命科學學院分子感染與免疫實驗室 上海 200438)

目的 研究核仁素核酸適配體(AS1411)介導信號轉導與轉錄激活因子3 (signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)靶向抗腫瘤的作用。方法 以RNA為耦聯分子,連接靶向分子AS1411和效應分子ASO。以RNA Structure軟件對預合成的不同RNA堿基耦聯構建的嵌合體分子二級結構進行預測分析。以瓊脂糖凝膠電泳檢測嵌合體分子在血清及細胞裂解液中的穩定性。通過流式細胞術和熒光共聚焦實驗檢測AS1411介導STAT3 ASO進入腫瘤細胞的情況。通過CCK-8試劑盒檢測STAT3 ASO對腫瘤細胞生長的抑制情況。通過RT-PCR和Western blot分析ASO對腫瘤生長相關基因表達的影響。結果 AS1411可介導STAT3 ASO高效進入腫瘤細胞,抑制C-myc、CyclinD1、Bcl-xl和PD-L1基因的轉錄和翻譯,并能抑制Du145細胞的生長。結論 AS1411可介導STAT3 ASO靶向進入腫瘤細胞,從而發揮抗腫瘤的作用。

反義寡核苷酸; AS1411; 抗腫瘤; 靶向

腫瘤是威脅公共健康的一類嚴重的疾病。近年來,我國腫瘤的發病率及死亡率均逐年上升。免疫抗腫瘤療法是近年來新興的抗腫瘤治療手段,主要包括以單克隆抗體介導的單抗藥物療法和嵌合抗原受體T細胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)[1-2],此類方法雖有良好的靶向性及較好的療效,但由于應用范圍及作用時效的限制,臨床使用也存在一定的局限[3-4]。因此,研發新型低免疫原性小分子靶向藥物依然十分必要。

核酸適配體是寡聚體單鏈DNA或RNA,可高親和力、高特異性結合目標蛋白受體、多肽、胞內生物大分子[5]。核仁素核酸適配體AS1411為26個堿基的單鏈DNA,序列為5’-GGTGGTGGTGGT-TGTGGTGGTGGTGG-3’,可高度特異性結合細胞膜表面核仁素蛋白,親和常數(Kd)為(8.37±0.75)nmol/L。由于核仁素在正常細胞表面不表達,僅在癌細胞或腫瘤相關內皮細胞表面表達,且在細胞表面與胞質之間穿梭[6-9],是非常理想的靶向藥物結合點。研究表明,AS1411結合腫瘤細胞膜核仁素后,可誘導大胞飲作用(macropinocytosis)而快速進入細胞,并通過誘導EGFR、Akt、p38和Rac1活性進一步促進大胞飲作用,最終導致非凋亡性細胞死亡[10-11]。因此,AS1411作為靶向分子具有親和力高、特異性強、相對分子質量小、無免疫原性、快速進入胞質、熱穩定性強、易于合成和生產(成本低)等顯著優勢,是一個十分理想的靶向抗腫瘤藥物載體。信號轉導與轉錄激活因子(signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)是一個與腫瘤高度相關的細胞內調控分子,可促進成纖維細胞在淋巴結中成瘤,被認為是一個癌基因[12-13]。它在多數癌細胞以及腫瘤微環境中浸潤的T細胞中呈活性形式,而在非活化的正常細胞中呈失活狀態,且不是分化細胞生存所必需的[14]。Kortylewski等[15]研究表明,通過誘導小鼠造血細胞STAT3基因敲除,可顯著增強DC細胞、T細胞、NK細胞及中性粒細胞的抗腫瘤活性,對黑色素瘤及膀胱癌有明顯的抑制作用。因此,STAT3被認為是一個很好的抗腫瘤靶標。本研究通過將AS1411和STAT3反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)耦聯起來,研究該嵌合體分子在抗腫瘤中的應用,以期為腫瘤治療提供一定的科學依據。

材 料 和 方 法

主要試劑及材料 RT-PCR引物及耦聯分子由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成(表1,表2);Du145細胞購自ATCC (HTB-81TM);胎牛血清、Tripson、DMEM高糖培養基、無酶分離液購自美國Gibco公司;細胞級PBS購自加拿大Wisent公司;Trizol購自美國Invitrogen 公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和qPCR SYBR Master Mix購自日本TOYOBO公司;DAPI購自上海碧云天生物技術有限公司;氯仿、乙醇、異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司;CCK-8 細胞活性檢測試劑購自上海翊圣生物科技有限公司;SpectraMax M5多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司;臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司;BB16UV型CO2培養箱購自德國Heraeus公司;LSM710型高感度激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

嵌合體二級結構預測 以RNA Structure軟件對預合成的不同RNA堿基耦聯構建的嵌合體分子二級結構進行預測分析。

嵌合體分子血清穩定性檢測 以去RNA酶水溶解各嵌合體寡核酸,配制濃度為10 nmol/L;取9μL核仁素核酸適配體嵌合體溶液,加入1μL血清,37 ℃下分別孵育0.5、1、2、3和4 h;以3%瓊脂糖膠電泳15 min,檢測嵌合體分子的完整性。

嵌合體分子細胞裂解液穩定性檢測 取Du145細胞約1×107個,以無酶分離液收集細胞;加入400μL PBS洗滌1次;加入100μL PBS重懸浮;-70 ℃反復凍溶吹打3次,使細胞破裂釋放細胞質;100×g離心3 min,取上清細胞裂解液,-70 ℃保存備用;取嵌合體分子各8μL,分別加入上述細胞裂解液2μL,37 ℃下分別孵育0.5、1、2和4 h;以3%瓊脂糖膠電泳15 min,檢測嵌合體分子的完整性。

表1 嵌合體分子堿基序列及修飾

Small letter indicated RNA.

表2 RT-PCR引物

流式細胞術檢測 取Du145細胞接種于12孔板(2×105/孔),加入DMEM完全培養基1 mL,5% CO2、37 ℃培養48 h。取3孔細胞,分別加入FAM熒光標記嵌合體分子、AS1411和效應分子各10μL,使其終濃度達100 nmol/L,5% CO2、37 ℃培養1 h,另取3孔細胞加入PBS作為空白對照;吸棄培養基,消化后清洗2次,PBS重懸,以流式細胞術分析FAM陽性細胞數量及其比例。

熒光共聚焦顯微鏡 取6孔細胞培養板,加入1 mL DMEM培養基(含10%胎牛血清,雙抗);各孔加入1塊無菌蓋玻片,沉底,無氣泡;接種適量腫瘤細胞(1 mL)于蓋玻片之上,以DMEM (含10%胎牛血清),5% CO2、37 ℃培養48 h;分別加入熒光標記嵌合體分子、AS1411和效應分子各20μL,使其終濃度達100 nmol/L,5% CO2、37 ℃培養1 h;加入DAPI (100×) 10μL,5% CO2、37 ℃孵育20 min;吸棄培養基,加入1 mL PBS洗滌1次;取出蓋玻片,晾干,以50%甘油(以PBS稀釋)倒置吸附于載破片;高感度激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結果。

細胞生長抑制實驗 取Du145細胞100μL (100 個/μL)接種于96孔板,每孔10 000 個細胞,5% CO2、37 ℃培養12 h;分別加入實驗組嵌合體分子、對照組嵌合體分子各1μL (使其終濃度為100 nmol/L),以及空白對照,各組重復4孔;5% CO2、37 ℃分別繼續培養24、48及72 h,以檢測細胞增殖;各孔分別加入5μL CCK-8試劑,5% CO2、37 ℃繼續培養3 h;以Spectrum M5檢測450 nm下各孔細胞的吸光度值(D)。

RT-PCR檢測 運用real-time PCR的方法檢測Du145細胞中C-myc、CyclinD1、Bcl-Xl和PD-L1基因mRNA的表達。以Trizol法抽提總的RNA,逆轉錄成cDNA。20μL反應體系包括:qPCR SYBR Master Mix 10μL、cDNA模板3μL、上下游引物各1μL、ddH2O 4μL。PCR反應條件為:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;58 ℃,30 s;72 ℃,1 min;循環40次。

Western blot檢測 運用Western blot檢測Du145細胞中C-myc、Cyclin D1、Bcl-xL和PD-L1蛋白質水平。將Du145細胞裂解,提取組織蛋白質,定量并分離,轉膜后分別與相應蛋白質抗體孵育并顯色。

結 果

嵌合體分子的二級結構 在本研究中,設計通過RNA堿基耦聯核仁素核酸適配體AS1411和STAT3 ASO構建嵌合體分子,從而介導高度靶向特異性給藥。為明確耦聯分子是否影響AS1411二級結構及是否結合核仁素,以RNA Structure軟件分析耦聯分子二級結構。如圖1所示,C、G連接的AS-ASO二級結構基本一致,但A耦聯的AS-ASO結構有所不同。但無論哪種連接,核酸適配體AS1411 5’端大部分DNA呈單鏈狀態,僅在16個堿基后有3～4個堿基構成的堿基對,且并非完全匹配。因此,認為RNA堿基(A、C、G)單堿基或雙堿基耦聯的AS-ASO嵌合體分子二級結構基本一致,不會對AS1411核仁素的親和力造成大的影響。

圖1 嵌合體分子二級結構

嵌合體分子在血清中的穩定性 合成的嵌合體分子若能在血清中穩定存在,而進入細胞后又可快速分離,那就不會在血液循環系統中過早釋放效應分子而造成藥物毒性作用和不良反應。考慮到嘧啶堿基穩定性更差,因此實驗設計為:分別以RNA單堿基A、C、G或雙堿基AA、AG、GA、GG、CG耦聯核仁素核酸適配AS1411和STAT3 ASO,分別以未耦聯的AS1411 (N)和DNA耦聯的嵌合體分子(P)作對照(圖2)。AS-ASO-C及AS-ASO-CG在10%血清中孵育0.5 h即有大量降解,到4 h時已基本完全降解,提示嘧啶堿基極易被降解;AS-ASO-A、AS-ASO-G在4 h后有少許降解;AS-ASO-AA、AS-ASO-AG、AS-ASO-GA隨時間延長逐漸降解,而AS-ASO-GG在4 h后基本與開始時一致,無降解。結果提示,嘌呤RNA雙堿基可在血清中穩定存在較長時間。因此,若該RNA連接可在細胞內被快速降解,則可作為理想的耦聯分子連接AS1411和效應分子。

嵌合體分子在細胞裂解液中的穩定性 進一步分析AS-ASO-AA、AS-ASO-AG、AS-ASO-GG、AS-ASO-GA在細胞裂解液中的穩定性。如圖3所示,上述嵌合體分子在20%細胞裂解液中孵育30 min即出現2條條帶,2 h后則大部分裂解,而4 h后幾乎完全裂解釋放ASO。結合血清穩定性實驗結果,說明以腺嘌呤RNA雙堿基耦聯構建的嵌合體分子可在血清中穩定存在至少4 h,而進入細胞后則在0.5 h內即開始裂解釋放效應分子。這提示以腺嘌呤RNA雙堿基耦聯構建嵌合體分子可能介導靶向特異性而高效抗腫瘤。由于各嵌合體穩定性無顯著差異,因此以gg (RAN)偶聯嵌合體進行后續研究。

圖2 嵌合體分子在10%血清中的穩定性

圖3 嵌合體分子在細胞裂解液中的穩定性

嵌合體分子可高效進入腫瘤細胞 為驗證核仁素核酸適配體AS1411是否可有效介導ASO進入細胞,以熒光染料FAM標記ASO,首先通過流式細胞術予以驗證。以FAM標記的AS1411 (AS1411-FAM)為陽性對照,以FAM標記的效應分子ASO (ASO-FAM)為陰性對照。結果如圖4所示,陽性對照組AS1411細胞FAM平均熒光強度值(mean fluorescence intensity,MFI) 顯著提高,是ASO-FAM組的1.44倍(P<0.01);嵌合體分子AS-ASO-GG組與陽性對照組結果基本一致,是ASO-FAM組的1.33倍(P<0.01)。該結果說明AS1411耦聯的嵌合體分子可以高效介導寡核苷酸ASO進入腫瘤細胞。

A:Results of positive control.The black curve showed ASO-FAM negative (control) and the red curve showed AS1411-FAM (positive control).B:Results of chimeric molecule.The black curve showed ASO-FAM (control) and the blue curve showed AS-ASO-GG-FAM (positive control).C:Statistical analysis of MFI.The MFI levels of AS1411 and AS-ASO-GG were higher than ASO-FAM (P<0.01).MFI:Mean fluorescence intensity.

圖4 嵌合分子的流式細胞實驗分析結果

Fig 4 Results of chimeric molecules analyzed by flow cytometry

熒光共聚焦實驗驗證嵌合體分子進入腫瘤細胞為進一步驗證上述流式細胞術結果,再次通過熒光共聚焦實驗予以驗證。同樣以AS1411-FAM和ASO-FAM為對照。圖5為共聚焦熒光顯微鏡檢測結果,其中藍色為核仁DAPI染色結果,綠色為FAM染色結果。由圖5可見,AS1411組綠色熒光多在細胞核中富集而胞質中較少;AS-ASO-GG組則相反,胞質中較多而核仁中較少;對照ASO組則基本無熒光。該結果提示AS1411高效結合核仁素,可介導耦聯的效應分子高效進入Du145細胞;AS-ASO-GG在胞質中熒光強而核仁中弱,提示嵌合體分子進入細胞后快速裂解而使ASO滯留在胞質中。上述結果說明,以AS1411為靶向分子,通過雙嘌呤RNA堿基(GG)耦聯ASO嵌合體分子,可高效進入靶細胞,并且在胞質中釋放效應分子ASO。

圖5 嵌合分子的共聚焦熒光顯微鏡檢測結果(400×)

AS-ASO-GG抑制細胞生長 為驗證構建的嵌合體分子是否可以有效抑制腫瘤細胞生長,實驗以空白組為對照,通過CCK-8試劑盒檢測給藥24 h后450 nm處的D值,分析RNA雙堿基gg (RNA)耦聯AS1411和單獨AS1411在不同濃度下對Du145細胞的生長抑制作用(圖6)。可見,單獨AS1411和空白對照組對Du145生長無顯著影響;AS-ASO-GG嵌合體僅在5μmol/L時可顯著抑制腫瘤細胞生長,是單獨AS1411的68.0%,且顯著低于空白對照組。結果提示,耦聯ASO構建的嵌合體分子在較高濃度下才能有效抑制腫瘤細胞生長,這可能與該ASO對STAT3沉默活性有限有關。

圖6 AS-ASO-GG抑制Du145細胞生長

RT-PCR檢測AS-ASO-GG抑制腫瘤細胞生長相關基因的表達 為驗證AS-ASO-GG (5μmol/L)是否有效抑制Du145細胞腫瘤生長相關基因的表達,以RT-PCR分析給藥48 h后,腫瘤相關基因Bcl-xl、CyclinD1、C-myc和PD-L1的mRNA相對水平。以單獨AS1411和空白為對照(圖7),mRNA相對定量檢測結果顯示,相對于空白對照組,AS-ASO-GG組C-myc、CyclinD1、Bcl-xl、和PD-L1的mRNA相對水平分別下調66.2%、54.5%、49.8%和61.3% (P<0.05);而單獨AS1411無顯著差異。說明AS-ASO-GG可以有效抑制腫瘤相關基因表達。

圖7 AS-ASO-GG抑制腫瘤相關基因的轉錄

Western blot檢測AS-ASO-GG抑制腫瘤細胞生長相關基因表達 為了進一步在蛋白質水平驗證AS-ASO-GG (5μmol/L) 抑制Du145細胞腫瘤生長相關基因的表達情況,以Western blot分析給藥48 h后,腫瘤相關基因Bcl-xl、CyclinD1、C-myc和PD-L1的蛋白質水平。以單獨AS1411和空白為對照(圖8),相對于空白組,AS-ASO-GG腫瘤相關基因的蛋白質水平明顯下降,而單獨AS1411組則無明顯差異。這說明AS-ASO-GG可有效降低腫瘤相關基因的蛋白質水平。

討 論

靶向特異性是當前精準醫學研究的重要特征,尤其對于新型抗腫瘤治療藥物,更是先決條件。目前比較常用的治療方法中,缺乏特異性的化療、放療和手術治療常伴有嚴重的毒性作用和不良反應,嚴重破壞免疫系統功能,給患者帶來更大的痛苦[16]。因此開發具有靶向功能并特異性殺滅腫瘤細胞的藥物是精準醫學研究的重要方向。目前開發的新型抗腫瘤療法,如單克隆抗體藥物、CAR-T細胞等都顯著提高了其抗腫瘤治療靶向性,但也都存在一定的局限性,因此開發新的、靶向性更高的藥物迫在眉睫[1-2]。

圖8 AS-ASO-GG抑制腫瘤相關基因的表達

核酸適配體為單鏈DNA或RNA寡核苷酸,與目標蛋白受體、多肽、胞內生物大分子等具有高親和力、高特異性的結合[17-19]。相比于蛋白質抗體,核酸適配體不但具有更高的親和力和靶向特異性[5],還具有如下顯著優點:(1)分子量小,在體內更容易通過組織障礙到達病灶部位;(2)無免疫原性,不易刺激機體產生抗體;(3)熱穩定性強,具有穩定的空間結構;(4)可以方便快速大規模工業化合成;(5)生產成本低廉[5,17]。因此,核酸適配體是理想的精準抗腫瘤治療藥物。尤其是核仁素核酸適配體AS1411,可高特異性、高親和力結合癌細胞表面的核仁素而對正常細胞無親和力,是十分理想的抗腫瘤藥物靶向分子[6-9]。

目前核仁素核酸適配體AS1411已經在抗腫瘤研究中獲得廣泛應用,主要包括作為阻斷劑直接抗腫瘤治療和作為載體介導藥物靶向殺傷腫瘤細胞。作為載體是AS1411更重要的作用,也是目前靶向抗腫瘤研究的重點手段,但各方法均存在一定的缺陷。Oh等[20]利用點擊化學技術以PEG將阿霉素耦聯至AS1411,從而靶向并有效減少藥物毒性作用和不良反應,但該方法僅限于含有羧基結構的特殊藥物。利用核酸適配體AS1411耦聯納米顆粒或脂質體,可增加靶向性、提高裝載藥物的抗腫瘤活性并降低毒性作用和不良反應,表現出更強的靶向特異性殺傷腫瘤效果[21-22],但這同時加劇了脂質體的不穩定性,且其靶向性依然欠佳。采用堿基互補配對是構建AS1411嵌合體的另一種方式。Subramanian等[23]利用該原理將存活蛋白脫氧核酶耦聯至AS1411,實現了特異性靶向藥物投遞,但活性不佳,并且以該方法構建的嵌合體熱穩定性很差,依然具有免疫原性等不足。

本研究設計的AS1411-RNA-ASO嵌合體分子,以AS1411為靶向分子,利用RNA堿基耦聯效應分子ASO,從而使ASO能夠靶向進入核仁素陽性的腫瘤細胞。實驗結果表明,以RNA雙堿基gg耦聯的嵌合體分子可在血清中較長時間穩定存在,而在胞質中快速分解釋放耦聯的效應分子。熒光共聚焦實驗證明,AS1411可快速進入腫瘤細胞并在核仁富集,而絕大部分熒光標記的效應分子卻滯留在胞質中,說明嵌合體分子進入細胞后可迅速釋放耦聯的效應分子。進一步的生長抑制實驗表明,嵌合體分子 AS-ASO-GG可有效抑制Du145細胞生長,并抑制Bcl-xL、CyclinD1、C-myc和PD-L1基因的轉錄與翻譯。

本研究利用AS1411介導STAT3 ASO靶向給藥,可顯著提高藥物投遞效率,尤其是STAT3 ASO具有很強的抗腫瘤活性。相比于其他方法,以RNA堿基耦聯AS1411和STAT3 ASO構建的嵌合分子具有腫瘤靶向性強、活性高、穩定強、進入腫瘤細胞后起效快的特點。且由于AS1411和STAT3 ASO本身均為核酸類小分子抗腫瘤藥物,而對正常細胞無顯著的毒性作用[18,24],因此構建的嵌合體分子還具有低毒性作用、弱免疫原性及適合長期給藥等優勢。

綜上所述,以RNA雙嘌呤堿基(gg)耦聯核仁素核酸適配體AS1411和ASO構建的嵌合體分子可高效進入腫瘤細胞,并在細胞中快速釋放ASO。其中AS-ASO-GG嵌合體可顯著下調Bcl-xL、CyclinD1、C-myc和PD-L1的mRNA和蛋白質水平并抑制Du145細胞生長,為進一步的精準抗腫瘤治療提供了實驗依據。

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A preliminary study of AS1411 mediated STAT3 antisense oligonucleotide targeting tumor cells

LIU Bao-xiu, HUANG Jian-sheng, ZHU Nai-shuo△

(LaboratoryofMolecularInfectionandImmunology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Objective To observe the effect of AS1411-mediated signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) antisense oligonucleotide (ASO) targeting tumor cells. Methods RNA was used as coupling molecules to link the targeting molecules AS1411 and effector molecules ASO.Prediction and analysis of the secondary structure of the pre-synthesis of chimeric molecules by RNA Structure software.Agarose gel electrophoresis was used to test the stability of chimeric molecules in serum and cell lysis solution.Using flow cytometry and confocal fluorescence microscope were used to estimate the internalization of AS1411-mediated STAT3 ASO.Inhibitory effect of ASO on the growth of tumor cells was detected by CCK-8 kit.RT-PCR and Western blot was used to measure the expression levels of tumor related genes.Results STAT3 ASOs mediated by AS1411 can enter tumor cells efficiently to inhibit the transcription and translation ofC-myc,CyclinD1,Bcl-xlandPD-L1 gene,and also can inhibit the growth of Du145 cells. Conclusions AS1411-mediated STAT3 ASO can enter tumor cells and act as anti-tumor medicine.

antisense oligonucleotide; AS1411; anti-tumor; targeting

國家自然科學基金(30901315,30970144);國家863計劃重大課題(2011AA02A114);上海市科委支撐項目(13431900602)

R73-36

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.005

2016-10-31;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:nzhu@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30901315,30970144),the National High Technology Research and Development Program of China (2011AA02A114) and the Project Supported by Shanghai Committee of Science and Technology (13431900602).