腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002的合成與初步生物學評價

閆賦琴，周衛華，孫小萌，劉曉軍

(中國武警總醫院，北京 100039 )

腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002的合成與初步生物學評價

閆賦琴，周衛華，孫小萌，劉曉軍

(中國武警總醫院，北京 100039 )

腺苷A2A受體與中樞神經退行性疾病密切相關，正電子核素標記的腺苷A2A受體顯像劑可用于帕金森病(PD)的診斷與療效評價。本研究采用碳-11標記[(E)-1，3-二乙基-8-(3，4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3，7-雙氫-1H-嘌呤-2，6-二酮](KW6002)制備11C-KW6002，并進行正常鼠與PD模型鼠microPET顯像。結果顯示，以去甲基KW6002為標記前體，在NaOH條件下與三氟甲基磺酰基碳-11甲烷(11CH3-Trifcate)反應，標記率達56%(衰變校正，n=3)。經制備HPLC分離和固相萃取，產品放化純度>99.5%，比活度為1.5×1014Bq/g。11C-KW6002的microPET顯像結果顯示，正常大鼠雙側紋狀體呈對稱顯像，PD模型鼠中毀損側紋狀體放射性較對側明顯增加，而同一模型的11C-CFT顯像為毀損側紋狀體放射性缺失。表明11C-KW6002為具有臨床應用的潛在腺苷A2A受體顯像劑。

腺苷A2A受體；11C-KW6002；合成；microPET；顯像劑

帕金森病(PD)是中腦黑質多巴胺能神經元缺失，導致黑質紋狀體通路功能異常的一種神經系統退行性疾病。目前，PD的藥物治療只能緩解癥狀，不能從根本上減輕多巴胺能神經元的惡化。腺苷A2A受體拮抗劑可以阻斷紋狀體內A2A的高表達，同時能抑制單胺氧化酶，達到治療PD的效果，為治療PD的新型靶點和藥物[1]。腺苷A2A靶點PD的診斷與療效監測，如123I-MNI-420，18F-MRS5425 和18F-MNI-444等，均顯示了良好的效果[2-4]。Kyowa Hakko Kirin公司已將腺苷A2A的拮抗劑伊曲茶堿([(E)-1，3-二乙基-8-(3，4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3，7-雙氫-1H-嘌呤-2，6-二酮]，KW6002)進行臨床三期試驗以證實治療PD的效果。KW6002與腺苷A2A高特異性結合(抑制常數Ki=12 nmol/L)，而與多巴受體亞型、去甲腎上腺素受體、5-HT受體及乙酰膽堿(acetylcholine, ACH)受體幾乎沒有親和力，正電子核素標記的KW6002可用于PD的診斷與療效監測[5]。本研究擬采用碳-11標記KW6002制備11C-KW6002，考察11C-KW6002在正常鼠及PD模型鼠上的生物分布及顯像，評價11C-KW6002作為腺苷A2A受體顯像劑的潛在價值。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

HM-20 回旋加速器：日本住友重機械株式會社；PET-CM-3H-IT-Ⅰ型碳-11多功能合成模塊：配備液相碘代甲烷合成儀、Triflate在線轉換、半制備HPLC系統(配紫外和放射檢測器)，派特(北京)科技有限公司；分析型HPLC儀、Waters2487紫外檢測器和BioScan Flowcount放射檢測器：美國BioScan公司；eXPlore

Vista 小動物PET/CT成像系統：美國GE公司；Sep-Pak C-18柱：美國Waters公司。

1.2 主要試劑

1 mol/L氫化鋁鋰/四氫呋喃溶液、丙酮：美國Aldrich公司；57%氫碘酸：百靈威J&K公司；去甲基KW6002和KW6002標準品：美國NIH的郎立新博士惠贈；氫氧化鈉(AR)：北京試劑廠。

1.3 實驗動物

正常Sprqgue-Dawley大鼠10只，均為雄性，體重180～200 g；PD模型鼠3只，雄性，體重210～230 g。SCXK(京)2016-0011，北京維通華實驗技術有限公司提供。

2 實驗方法

2.111C-CH3I合成與在線轉換[6]

HM-20回旋加速器質子轟擊含0.5%氧氣的氮靶，經14N(p,α)11C核反應在靶內生成11CO2，將11CO2轉輸至PET-CM-3H-IT碳-11多功能合成模塊，通過模塊上的不銹鋼LOOP環(浸于液氮)捕獲。捕獲完畢，移走液氮，空氣加熱LOOP環，環中11CO2釋放到0.3 mL 1 mol/L的氫化鋁鋰/四氫呋喃溶液反應管中。通入氮氣并加熱反應管，除四氫呋喃至干。冷卻后加入0.25 mL 57%氫碘酸。加熱反應管并通入氮氣，生成的11CH3I被氮氣載出。11CH3I流經加熱至200 ℃的Triflate-Ag粉/石墨柱，轉化為11CH3-Triflate。

2.211C-KW6002的合成與純化

11C-KW6002合成路線示于圖1。稱取0.5 mg去甲基KW6002溶解于0.2 mL丙酮中，加入5 μL 2mol/L NaOH溶液[7]，冷卻條件下通入11CH3-Triflate，待反應管的放射性讀數達到最大并開始下降時，停止通入氣體。密封反應管，加熱至80 ℃，反應2 min。

圖1 11C-KW6002合成線路圖Fig.1 The scheme of synthesis of 11C-KW6002

產物經半制備HPLC分離，分離柱為Alltech C-18(250 mm×10 mm)，流動相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L甲酸銨水溶液)∶V(乙酸)=35∶64.5∶0.5，流速6 mL/min，收集8～10 min的含放射性峰流動相。將收集的溶液用水稀釋，經固相萃取柱(Sep Pak C-18)萃取后，用1 mL乙醇洗脫產品。

2.3 標記條件

分別采用丙酮、乙腈和DMSO為溶劑，以及不同的堿NaOH、Na2CO3調節pH，研究不同溶劑以及不同的堿對11C-KW6002標記率的影響。

2.4 質量控制

采用HPLC測量放化純度和比活度。Waters的HPLC，紫外檢測波長為254 nm，分析色譜柱為ODS柱(Gemini C-18 5 μ 4.6 mm×150 mm)，流動與半制備HPLC相同，流速1 mL/min，分別對制備樣品進樣、KW6002標準品單獨進樣和樣品與標準品混和物進樣，測量樣品的相對保留時間及色譜峰面積，計算放化純度與比活度。

2.5 動物模型

按文獻方法制備帕金森病模型[8]，選用健康成年Sprqgue-Dawley大鼠，在麻醉狀態下，利用大鼠腦立體定位儀將10 μL 2 g/L的6羥多巴(6-hydroxydopamine， 6-OHDA)注射到中腦腹側背蓋區和黑質致密部，術后2周采用腹腔注射阿撲嗎啡加旋轉的方式評估模型，連續測量4周，向健側旋轉大于7 圈/min即為模型成功。

2.6 microPET/CT顯像

取正常大鼠和PD模型鼠各3只，尾靜脈注射11C-KW6002(74 MBq)，注射后20 min將其置于microPET/CT掃描床上，持續用異氟烷氣體麻醉，行常規microPET/CT掃描。為了驗證和對比，選同一只模型鼠，間隔1 d注射多巴胺轉運蛋白顯像劑11C-CFT，注射后40 min行microPET/CT掃描。

3 結果與討論

3.1 產品鑒別

去甲基KW6002有三個叔胺，但受雙鍵影響，這三個氮基本沒有活性，苯酚在堿性條件下成為酚氧基離子，作為親核試劑進攻11CH3-Triflate，Triflate離去，發生SN親核反應。

收集主產品放射性峰，并經固相萃取，在分析型HPLC上僅一個放射性峰(圖2b，保留時間tR=6.65 min)，該峰與標準品的紫外吸收峰(圖2a)在保留時間上一致(加上兩個檢測器之間的死體積)。同時，如果采用該流動相和分析柱，單獨進放射性原料11CH3-Triflate時，僅有一個放射性峰(tR=2.5 min)，說明tR=6.65 min為前體甲基化產品11C-KW6002。產品的放化純度>99.5%，經標準品計算，比活度為1.5×1014Bq/g。

a——標準品的紫外圖譜；b——11C-KW6002放射性圖譜圖2 HPLC圖譜a——UV HPLC chromatogram of 12C-KW6002；b——Radioactivity HPLC chromatogram of 11C-KW6002Fig.2 HPLC chromatogram

3.211C-KW6002標記條件

采用丙酮、乙腈和DMSO為溶劑時標記效率(衰變校正，n=3)分別為56%、42%、48%，丙酮的標記效率最高；采用10 μmol/L的NaOH和10 μmol/L的Na2CO3時標記效率(衰變校正，n=3)分別為56%、12%，Na2CO3的標記效率低于NaOH，可能是酚的酸性較弱，需要強堿才能生成酚氧根負離子，以便進行親核反應。

將0.5 mg去甲基KW6002，用0.2 mL丙酮溶解，并加入5 μL 2 mol/L NaOH溶液，標記效率可達到56%(衰變校正，n=3)。與多巴胺D2受體顯像劑11C-Racloprdie比較，11C-KW6002的標記主產品更容易分離，且標記率高于11C-Racloprdie[9]。

3.3 正常大鼠microPET/CT顯像

正常大鼠注射11C-KW6002后行microPET/CT腦顯像，顯像結果示于圖3。由圖3結果可見，大鼠淚腺、唾液腺等腺體顯像清晰且有放射性濃聚，橫斷面、冠狀面大鼠紋狀體顯像對稱分布，左右雙側放射性濃聚程度一致。

3.4 PD模型大鼠microPET/CT顯像

相同條件下，PD模型大鼠腦的橫斷面、冠狀面大鼠紋狀體顯像呈不對稱分布，右側(6-OHDA毀損側)放射性濃聚程度高于左側(圖4a)，經SUV計算，右側/左側紋狀體放射性攝取比為2.4。為了驗證該模型，對同一模型鼠間隔1 d，采用多巴胺轉運蛋白11C-CFT顯像(圖4b)，左右顯像不對稱，其中右側幾乎缺失，僅見左側紋狀體顯像，表明該模型成功[7]。同時證明PD模型鼠上毀損側多巴胺轉運蛋白受體明顯下降，而腺苷A2A受體上調。

圖3 正常大鼠11C-KW6002 microPET/CT顯像Fig.3 The microPET/CT imaging of 11C-KW6002 in normal rat

a——11C-KW6002；b——11C-CFT圖4 PD模型鼠腦microPET/CT顯像a——11C-KW6002；b——11C-CFTFig.4 The microPET/CT imaging in the same one PD module rat

4 小結

強堿性條件下，11CH3-Triflat與去甲基KW6002在丙酮溶液中反應，得到11C-KW6002 標記率為56%(衰變校正，n=3)，經半制備HPLC純化及固相萃取，產品的放化純度大于99.5%。經正常鼠及PD模型鼠microPET顯像，腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002在正常鼠上雙側紋狀體顯像對稱，而模型鼠的毀損側放射性攝取增高。11C-KW6002具有潛在臨床應用價值，可用于以腺苷A2A受體為靶點的PD診斷與療效評價顯像劑。

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The Synthesis and Evaluation of11C-KW6002 as the PET Adenosine 2A Receptor Imaging Agent

YAN Fu-qin, ZHOU Wei-hua, SUN Xiao-meng, LIU Xiao-jun

(GeneralHospitalofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

PET with selective adenosine 2A receptor (A2A) radiotracers can be used to study a neurodegenerative disorders in vivo and to diagnose of PD. The PET radiotracer11C-KW6002 for imaging A2Awas synthesized and evaluated, in normal and PD module rats. The results showed that the labeling yield was 56% (decay corrected yield,n=3) when11CH3-Triflate reacted with nor-KW6002 under NaOH. The radiochemical purity of product was 99.5% with specific activity of 1.5×1014Bq/g. The balance of radioactivity in striatum was observed in normal rats with microPET. A significant raised radioactivity on the striatum of lesion compared with the normal side. The radioactivity was found absence on the striatum of lesion with11C-CFT.11C-KW6002 is a potential PET radiotracer for imaging A2A.

A2Areceptors;11C-KW6002; synthesis; microPET; imaging agent

2017-01-11;

2017-02-23

閆賦琴(1968—)，女，河北人，副主任藥師，主要從事臨床藥學研究

劉曉軍，主任醫師，E-mail: m13911735771@163.com

TL92+3；R817.9+2

A

1000-7512(2017)03-0204-05

10.7538/tws.2017.youxian.003