南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析

王迎兒，邢乃林，應(yīng)泉盛，張慧波, 2，黃蕓萍，王毓洪*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 寧波 315040； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

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南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析

王迎兒1，邢乃林1，應(yīng)泉盛1，張慧波1, 2，黃蕓萍1，王毓洪1*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 寧波 315040； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

以主要來(lái)源于浙江省的41份南瓜種質(zhì)資源為材料，利用26對(duì)南瓜SSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，41份種質(zhì)被分為4類，2類為白籽南瓜(各1份)，1類中國(guó)南瓜(35份)，1類印度南瓜(4份)。材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.45～0.96，平均為0.79。其中，中國(guó)南瓜類群種內(nèi)平均相似系數(shù)為0.86，印度南瓜類群種內(nèi)平均相似系數(shù)為0.67，這2個(gè)類群間的平均相似系數(shù)為0.54。所收集的浙江省種質(zhì)資源除其中2份外，均被分類為中國(guó)南瓜，平均遺傳相似系數(shù)為0.87。中國(guó)南瓜的親緣關(guān)系較印度南瓜近，種內(nèi)親緣關(guān)系較種間近。研究結(jié)果對(duì)浙江省南瓜種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用具有重要意義。

南瓜； 種質(zhì)資源； SSR； 聚類分析； 遺傳相似性

南瓜(CucurbitaL.)為1年生草本植物，屬于葫蘆科南瓜屬，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。栽培種主要分為5類，包括美洲南瓜(Cucurbitapepo)、中國(guó)南瓜(C.moschata)、印度南瓜(C.maxima)、黑籽南瓜(C.ficifolia)和灰籽南瓜(C.mixta)，用途廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富，變種繁多[1-2]。南瓜起源于美洲大陸，明代由東南亞、朝鮮和日本等地傳入我國(guó)，距今近500多年的歷史[3]。傳入中國(guó)后，由浙江、福建等東南沿海地區(qū)向內(nèi)地?cái)U(kuò)展，在多年栽培擴(kuò)展過(guò)程中產(chǎn)生了豐富的表型及遺傳變異。對(duì)育種工作者而言，種質(zhì)資源是品種培育的基礎(chǔ)，而種質(zhì)資源的收集及評(píng)價(jià)分析則是種質(zhì)資源利用的必需過(guò)程，可為雜交育種中親本選配提供依據(jù)，有利于優(yōu)良品種的選育。地方種質(zhì)資源在地區(qū)氣候環(huán)境適應(yīng)性方面具有一定優(yōu)勢(shì)，具有豐富的生物及非生物脅迫抗性遺傳資源，適宜用作地方品種的選育基礎(chǔ)[4]。因此，開發(fā)利用地方種質(zhì)資源已成為育種的重要發(fā)展方向，對(duì)品種選育具有重要意義。

遺傳多樣性是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，主要包括表型水平和分子水平2個(gè)方面。通過(guò)SSR等分子標(biāo)記在分子水平對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)，相對(duì)表型水平受環(huán)境影響較小，重復(fù)性及穩(wěn)定性較高，因此，在分子水平對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，可靠性更高[5-6]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為了從分子水平研究南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，已經(jīng)利用過(guò)氧化物同工酶[7]、RAPD[8-14]、AFLP[15]、SSR[16-18]、EST-SSR[19]、SRAP[20]、ISSR[13-14, 21]等分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外種質(zhì)資源進(jìn)行栽培種內(nèi)及栽培種間的遺傳多樣性進(jìn)行分析。但是作為南瓜在國(guó)內(nèi)傳播的重要節(jié)點(diǎn)，浙江相關(guān)的地方種質(zhì)資源少有涉及。本研究以浙江省為主的41份南瓜種質(zhì)資源為研究材料，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為南瓜種質(zhì)資源保護(hù)及新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共41份(表1)。分別為中國(guó)南瓜、印度南瓜、中國(guó)南瓜與印度南瓜雜交材料，主要來(lái)源于浙江省內(nèi)的農(nóng)家留種，少量為其他國(guó)家和地區(qū)引進(jìn)的材料。

1.2 處理設(shè)計(jì)

材料于2016年秋季種植于寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)設(shè)施大棚內(nèi)，每份材料定植15株。開花期對(duì)每份材料隨機(jī)選取4株取幼嫩葉片，混合后進(jìn)行基因組DNA提取。DNA提取方法參照文獻(xiàn)[22]。利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度，稀釋至20 ng·μL-1后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 種質(zhì)資源編號(hào)及類別

SSR引物序列參考文獻(xiàn)[23]，本研究選取其中擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的50對(duì)引物進(jìn)行分析，引物由上海英濰捷基生物公司合成，引物序列見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增體系10 μL：DNA(20 ng·μL-1)2 μL，10× PCR buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl20.8 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.16 μL，10 mmol·L-1Primer 1 μL，Taq酶(全式金)0.1 μL，dd H2O 4.94 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 30 s(每循環(huán)降0.7 ℃)，72 ℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，常規(guī)硝酸銀染色法銀染。

1.3 數(shù)據(jù)分析

為了后續(xù)SSR分析，對(duì)每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，出現(xiàn)及缺失的PCR擴(kuò)增帶紋分別賦值為1和0。通過(guò)NTSYSpc 2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得材料間的遺傳相似性及遺傳距離，并進(jìn)一步繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選

利用50對(duì)SSR引物對(duì)收集的41份南瓜種質(zhì)材料進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)顯示，26對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶141條，平均5.42條。擴(kuò)增多態(tài)性條帶最多的為標(biāo)記S198，共有17條，最少的為S125，只有1條。多態(tài)性信息含量平均0.58，S198的多態(tài)性信息含量最高，為0.91，S312的多態(tài)性信息含量最低，為0.32。圖1為SSR引物S264對(duì)41份南瓜種質(zhì)材料的擴(kuò)增電泳圖譜。

圖1 41份材料SSR引物S264的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 41份南瓜材料的遺傳相似性分析

基于SSR數(shù)據(jù)，通過(guò)NTSYSpc 2.10e統(tǒng)計(jì)41份南瓜資源的遺傳相似系數(shù)。材料間的遺傳相似系數(shù)為0.45～0.96，平均為0.79。其中51與52、79與84之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.96，表明這2對(duì)種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系最近。73與85之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.45，表明這2份種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 41份南瓜材料的聚類分析

利用26對(duì)SSR引物得出的電泳譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到聚類樹狀圖(圖2)。

表2 26對(duì)SSR引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

圖2 基于SSR分析的41份南瓜種質(zhì)材料的聚類結(jié)果

由圖2可知，在閾值為0.13時(shí)，41份南瓜種質(zhì)資源劃分為4個(gè)類群。第Ⅰ類群包括1份材料，編號(hào)47，為白籽南瓜；第Ⅱ類群包括4份材料(編號(hào)72、73、89、90)，為印度南瓜；第Ⅲ類群包括35份材料，為中國(guó)南瓜；第Ⅳ類群包括1份材料87，為白籽南瓜。

第Ⅰ類群與第Ⅱ類群的平均相似系數(shù)為0.61，編號(hào)47與90的相似系數(shù)達(dá)0.69，編號(hào)47與89的相似系數(shù)為0.55。第Ⅰ類群與第Ⅲ類群的平均相似系數(shù)為0.70，編號(hào)47與48的相似系數(shù)達(dá)0.77，編號(hào)47與83、91的相似系數(shù)為0.64。第Ⅰ類群與第Ⅳ類群的平均遺傳相似性為0.55。第Ⅱ類群與第Ⅲ類群的平均相似系數(shù)為0.54，編號(hào)51與90的相似系數(shù)達(dá)0.65，編號(hào)73與85的相似系數(shù)為0.45。第Ⅱ類群與第Ⅳ類群的平均相似系數(shù)為0.51，編號(hào)87與72的相似系數(shù)達(dá)0.53，編號(hào)87與90的相似系數(shù)為0.49。第Ⅲ類群與第Ⅳ類群的平均相似系數(shù)為0.62，編號(hào)87與59的相似系數(shù)達(dá)0.68，編號(hào)87與53的相似系數(shù)為0.58。第Ⅱ類群中，編號(hào)72與73的遺傳相似性最大為0.82，90與72、73的遺傳相似性最小為0.62，平均為0.67。第Ⅲ類群的平均遺傳相似性為0.86，編號(hào)79與84、51與52的遺傳相似性最大為0.96，編號(hào)63與91的遺傳相似性最小為0.73。47和87這2份白籽南瓜與印度南瓜的平均遺傳相似性為0.56，與中國(guó)南瓜的平均遺傳相似性為0.66。2份白籽南瓜與印度南瓜類群的遺傳相似性較中國(guó)南瓜類群低，表明所收集的2份雜交材料的中國(guó)南瓜背景較大。中國(guó)南瓜類群內(nèi)遺傳相似性顯著高于印度南瓜類群。除了編號(hào)87與印度南瓜類群外，印度南瓜和中國(guó)南瓜類群間的遺傳相似性最低，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。中國(guó)南瓜類群內(nèi)的遺傳相似性最高，內(nèi)部親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的為0.73，最高達(dá)到0.96；其中，浙江省的中國(guó)南瓜材料平均相似系數(shù)為0.87，編號(hào)79與84、51與52的相似系數(shù)最大，均為0.96；63與91的相似系數(shù)最小，為0.73。

3 討論

南瓜自明代傳入我國(guó)浙江和福建以來(lái)，迅速北上南下，成為解決人民溫飽的重要農(nóng)作物[24]。因此，收集并研究浙江地區(qū)南瓜種質(zhì)資源情況對(duì)了解我國(guó)南瓜的推廣及種質(zhì)資源利用和培育具有重要作用。本研究中，浙江地區(qū)收集的種質(zhì)資源主要為中國(guó)南瓜，平均遺傳相似系數(shù)為0.87，多個(gè)地區(qū)總體親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性不夠豐富。這或許與南瓜引入我國(guó)時(shí)間較短，自然及人為選擇壓力不大有關(guān)。因此，為選育優(yōu)良品種，仍需創(chuàng)造或引進(jìn)變異更豐富的種質(zhì)資源。

SSR分子標(biāo)記因其重復(fù)性高、基因組分布及數(shù)量豐富等優(yōu)勢(shì)而在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳進(jìn)化、分子育種等方面而被廣泛應(yīng)用[25]。但是在南瓜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中的應(yīng)用還較少[16-18]。最近，超過(guò)500對(duì)南瓜SSR分子標(biāo)記被公布[23]。本研究從中隨機(jī)選擇50對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)41份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果有26對(duì)分子標(biāo)記具有多樣性。這26對(duì)標(biāo)記平均擴(kuò)增多態(tài)性條帶5.42條，高于已知的4.18、2.4以及2.29[16-18]，這可能與所選擇的分子標(biāo)記位點(diǎn)受自然及人工選擇壓力較小有關(guān)。

本研究所用材料有印度南瓜、中國(guó)南瓜及白籽南瓜3類，其中2份白籽南瓜因?yàn)橛H緣關(guān)系較遠(yuǎn)而被分在2個(gè)類群。總體上，種間親緣關(guān)系較種內(nèi)遠(yuǎn)，中國(guó)南瓜種內(nèi)親緣關(guān)系較印度南瓜近。這與已發(fā)表的利用SSR、ISSR、SRAP等分子標(biāo)記分析結(jié)果一致[16, 26-27]。但與利用同工酶對(duì)南瓜親緣關(guān)系研究結(jié)果不一致，這可能與材料及標(biāo)記的選擇有關(guān)[7]。

目前蔬菜種子市場(chǎng)混亂，具有同名異物和同物異名現(xiàn)象。另外，由于農(nóng)家留種大多無(wú)名稱或名稱不清楚，極易造成種質(zhì)資源重復(fù)收集及收集遺漏。本研究中51與52、79與84間的遺傳相似性高達(dá)0.96，疑為同一材料短時(shí)間內(nèi)分離而來(lái)，已發(fā)表研究也有類似結(jié)果[27]。75與76這兩份來(lái)自浙江舟山的材料雖然具有同一名字，但材料間遺傳相似性為0.88，表明材料間具有一定程度的差異，對(duì)密本南瓜的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[26]。本研究中編號(hào)47的材料，因?yàn)榭勺越唤Y(jié)實(shí)收種，通過(guò)外觀初步歸為印度南瓜；但該材料為印度南瓜與中國(guó)南瓜的雜交材料，雖然可自交收種，但種子量較少，結(jié)合田間植株詳細(xì)表現(xiàn)，最終認(rèn)為該材料為種間雜交材料。

本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)收集的南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，進(jìn)一步分析了中國(guó)南瓜、印度南瓜及白籽南瓜3個(gè)栽培種的遺傳多樣性，構(gòu)建了聚類圖譜。雖然本研究中印度南瓜及白籽南瓜材料較少，但仍可以為南瓜親本選配和品種選育提供參考。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-04-25

寧波市科技富民惠民項(xiàng)目(2015C10053)；國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-26)；寧波市瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2014A22007)

王迎兒(1985—)，女，浙江寧波人，農(nóng)藝師，碩士，從事瓜類砧木育種工作，E-mail: wangyinger0601@sina.com。

王毓洪，E-mail: yhwangsc@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170721

S642.1

A

0528-9017(2017)07-1161-05

文獻(xiàn)著錄格式：王迎兒，邢乃林，應(yīng)泉盛，等. 南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(7)：1161-1165.