次烏頭堿對腦梗死大鼠神經功能與血清中t-PA，PAI-I含量水平的影響

梁華峰， 謝 靖， 申 婧， 田 鳳， 耿玉榮， 唐 娟， 劉春紅， 張惠麗

次烏頭堿對腦梗死大鼠神經功能與血清中t-PA，PAI-I含量水平的影響

梁華峰， 謝 靖， 申 婧， 田 鳳， 耿玉榮， 唐 娟， 劉春紅， 張惠麗

目的 通過建立腦梗死大鼠模型，探討次烏頭堿對神經功能與腦梗死大鼠血清中t-PA，PAI-I含量水平的影響。方法 大鼠隨機分為假手術組(Sham)，腦梗死組(CI)，次烏頭堿低劑量組(HA-L)、中劑量組(HA-M)和高劑量組(HA-H)，采用線栓法建立大鼠腦動脈閉塞模型，建模成功后，次烏頭堿低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予次烏頭堿灌胃0.25 mg/kg，0.75 mg/kg與2.25 mg/kg，每天1次，共給藥3 d。給藥完成后，對各組大鼠進行神經功能缺損評分，ELISA檢測血清中組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活抑制物(PAI-I)的含量水平，TTC染色檢測腦梗死體積，免疫印跡法檢測ICAM-1與VCAM-1蛋白表達水平。結果 與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，腦梗死大鼠的神經功能缺損評分顯著降低，血清中t-PA與PAI-I的含量水平明顯下降，腦梗死面積降低，腦組織中ICAM-1與VCAM-1蛋白表達明顯下降。結論 次烏頭堿能夠改善腦梗死大鼠的神經功能缺損狀態，可能與其影響纖溶系統以及ICAM-1與VCAM-1因子表達有關。

次烏頭堿； 腦梗死； 纖溶酶原； ICAM-1； VCAM-1

急性腦梗死是導致人類致殘與死亡的主要疾病之一。大量研究發現急性腦梗死的發病機制十分復雜，多種因素參與其中。目前的治療方法主要是采用回復缺血區的血液供應，改善局部的血液循壞，以達到在一定程度上恢復大腦功能[1]，但在臨床上并未取得十分顯著的成效。次烏頭堿(Hypaconitine，HA)是附子的主要成分之一，主要為二萜類雙酯型生物堿[2]，現代藥理學研究證明，附子具有強心、抗心律失常、鎮痛以及抗腫瘤等作用，臨床上，常用附子來治療急性心肌梗死引起的休克、冠心病等，但由于附子的毒性極強，需要經過炮制后才可使用。次烏頭堿是附子所含的二萜類雙酯型生物堿中毒性最弱者。目前關于次烏頭堿的研究較少，有研究表明次烏頭堿通過抑制鈣調控蛋白的表達和縫隙連接蛋白的磷酸化水平來影響心機收縮功能與節律變化[3]。我們通過建立腦梗死大鼠模型，觀察次烏頭堿對腦梗死大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠50只，雄性，SPF級，體重180～220 g，購于南京君科生物有限公司，適應性飼養7 d。

1.2 試驗試劑 次烏頭堿購自中國藥品生物制品鑒定所，t-PA與PAI-I的ELISA試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司，ICAM-1與VCAM-1抗體購自碧云天生物技術有限公司，β-actin的抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 實驗分組與給藥 按照數字隨機法將大鼠分為假手術組(Sham)，腦梗死組(CI)，次烏頭堿低劑量組(HA-L)、中劑量組(HA-M)和高劑量組(HA-H)，每組小鼠各10只，分籠飼養，造模成功后，烏頭堿低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予次烏頭堿灌胃0.25 mg/kg，0.75 mg/kg與2.25 mg/kg，每天一次，共給藥7 d，灌胃前現配置次烏頭堿混懸液。假手術組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4 腦梗死大鼠模型的建立 采用線栓法建立大鼠腦動脈閉塞模型，造模成功標準，參照Longa[4]進行神經功能缺陷評分，標準為：無神經系統功能缺損癥狀0分，活動正常1分，對側前肢不能完全伸展2分，爬行時向對側轉圈2分，行走時身體向偏癱側傾3分，不能自發行走，意識喪失4分。選取評分為1～3分的大鼠進入實驗。

1.5 取材 給藥完成后，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，一部分快速開胸，曝露心臟，心尖處剪開一小口，插管至升主動脈，快速滴注150 ml生理鹽水，然后用4 ℃的4%多聚甲醛400 ml灌注，持續1 h后，取腦，腦組織用4%多聚甲醛4 ℃固定2～4 h后，移入30%蔗糖液，置于冰凍切片機，連續切片，片厚20 μm。另一部分，取腦組織，迅速置于液氮中冷凍保存備用。

1.6 TTC染色檢測腦梗死體積 給藥完成后，麻醉大鼠后斷頭處死，取出完整腦組織，均勻切成5片冠狀切片，分別將腦片進入2%TTC溶液中，37 ℃孵育15 min，然后取出置于4%多聚甲醛固定24 h，觀察腦梗死體積，紅色區域為正常腦組織，蒼白色區域為梗死區。

1.7 ELISA法檢測t-PA，PAI-I含量水平 給藥完成后，眶靜脈采抗凝血，3000 r/min離心，取上層血清，采用商業t-PA，PAI-I的ELISA試劑盒檢測血清中t-PA，PAI-I的含量水平。

1.8 免疫印跡法 取出腦組織，在冰上剪碎勻漿，加入全細胞裂解液(RIPA)，冰浴中勻漿5 min，將勻漿液置于預冷的離心管中，冰上渦旋，4 ℃15000 r/min離心30 min，取上清液，進行蛋白定量，將樣品和緩沖液等體積混合上樣，進行電泳，電泳完成后轉膜，加入封閉液進行封閉2 h，加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜，加入對應的二抗，37 ℃孵育1 h，將膜取出后置于ECL試劑盒中反應約1 min，然后放入凝膠成像系統內進行曝光拍照，采用數字圖像分析軟件對目的條帶和內參條帶進行分析。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評分 除腦梗死組大鼠有一只造模后死亡，其他大鼠均存活。假手術組大鼠并無神經功能缺損的癥狀表現，腦梗死組大鼠均出現神經功能缺損的表現，采用次烏頭堿給藥的大鼠神經功能缺損評分明顯低于腦梗死組，如表1所示。

2.2 各組大鼠血清中t-PA，PAI-I含量水平的變化 與假手術組相比，腦梗死組大鼠血清中t-PA的含量顯著升高(P<0.05)；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，大鼠血清中中t-PA的含量下降(P<0.05)，并隨劑量增大而逐漸下降；與假手術組相比，腦梗死組大鼠血清中 PAI-I的含量明顯升高(P<0.05)；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，大鼠血清中PAI-I含量水平明顯下降，并隨劑量增大而下降(見表2)。

2.3 各組大鼠腦梗死體積 假手術組大鼠腦組織染色表現為均勻的紅色，腦梗死組大鼠腦組織染色出現大范圍的蒼白色梗死區，采用次烏頭堿處理后，大鼠腦組織中蒼白色的梗死區面積縮小(見表1)。

2.4 腦組織中ICAM-1與VCAM-1蛋白表達水平的變化 與假手術組相比，腦梗死組大鼠腦組織中的ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達水平顯著上升；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，低劑量組大鼠腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達無明顯變化，中劑量組與高劑量組均出現明顯下降(見圖2)。

表1 神經功能缺損評分±s)

與Sham組相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

表2 次烏頭堿對大鼠血清中t-PA，PAI-I含量 水平的影響

與Sham組相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

圖1 各組大鼠腦梗死體積的對比

與Sham相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

3 討 論

人體的纖溶系統主要是由纖溶酶原、纖溶酶、纖溶原激活劑(plasminogen activator，PA)和纖溶酶原抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAI)組成，然而纖溶酶的轉化主要是依賴血漿中游離的組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)的活性[5]。其中組織型纖溶酶原激活物又稱為內皮細胞的標記物，主要是血管內皮細胞生成與分泌的，具有激活纖溶酶原轉化成纖溶酶的作用，繼而激活整個纖溶系統，因此t-PA在血液中的含量可反映纖溶系統的功能[6]。纖溶酶原激活抑制劑-1通過與t-PA以1∶1形成分子復合物，從而使t-PA失活而發揮作用，在正常生理狀態下，血液中的t-PA與PAI-I處于動態平衡。成年大鼠大腦中的多個部位均有t-PA和PAI-I的表達[7]。本研究發現，腦梗死大鼠血液中t-PA的含量顯著上升，推測是由于腦梗死急性期纖溶酶原被激活，從而啟動纖溶系統，PAI-I含量上升，但幅度明顯小于t-PA，提示腦梗死大鼠的凝血功能與纖溶功能均被激活。而采用次烏頭堿給藥后，能夠緩解t-PA與PAI-I的下降，促進二者回到平衡狀態，從而維持纖溶系統的正常穩態。但目前國內外的文獻研究結果不盡相同，國外學者研究發現腦梗死患者血漿中t-PA含量水平在急性期降低，恢復期升高[8]，推測是由于腦梗死急性期中t-PA被大量消耗。而本實驗的結果與Hemandez等[9]發現腦梗死患者t-PA與PAI-1含量均顯著上升一致。

細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白超家族的一員，分布廣泛，炎癥介質能夠上調內皮細胞與其他非造血細胞ICAM-1與VCAM-1的表達[10]。研究發現線栓法建立的小鼠腦動脈栓塞模型試驗中，在缺血中心區與半暗帶區均可觀察到ICAM-1的陽性表達，并從缺血中心區向周邊逐漸增加[11]。本實驗中觀察到腦梗死大鼠的腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達均顯著升高，與前人研究結果相似，采用次烏頭堿給藥后，大鼠腦組織中的ICAM-1與VCAM-1蛋白表達明顯下降，推斷次烏頭堿具有降低腦梗死腦組織中ICAM-1與VCAM-1的表達，可能對阻斷炎癥的級聯反映與腦組織的損傷具有重要的作用。綜上所述，次烏頭堿能改善腦梗死大鼠的神經功能缺損狀態為次烏頭堿用于輔助治療腦梗死患者提供了一定的實驗依據。

[1]田金洲，時 晶，倪敬年，等. 腦梗死患者頸動脈斑塊與血瘀證的相關性研究[J]. 中華中醫藥雜志，2007，22(3)：149-152.

[2]劉秀秀，晁若冰. 反相離子對色譜法測定附子中生物堿成分[J]. 藥學學報，2006，41(4)：365-369.

[3]易明晶. 次烏頭堿對大鼠心肌CaM及Cx43表達的影響及甘草苷的干預作用[D]. 湖北大學，2011. 5.

[4]Zea Longa，Weinstein PR，Carvlson S，et al. Reversible middle cerebral arteryocclusion without craniectomyinrats[J]. Stroke，1989，20：17.

[5]Aziz CB，Omar N，Abdullah WZ，et al. Reduced fibrinogen，fibrinolytic biomarkers，and physical parameters after a weight-loss program in obese subjects[J]. N Am J Med Sci，2014，6(8)：377-382.

[6]蔣海河. 不同損傷因素對血管內皮細胞釋放vWF、PAI-1和t-PA的影響[D]. 中南大學，2008.

[7]Kanse SM，Benzakour O，Kanthou C，et al. Induction of vascular SMC proliferation by urokinase indicates a novel mechanism of action in vasoproliferative disorders[J]. ArteriosclerThrombVasc Bio，1997，17：2848-2854.

[8]Rosenberg GA，Navratil M. Metalloproteinase inhibition blocks edema in intracerebral hemorrhage in the rat[J]. Neurology，1997，48(4)：921-926.

[9]Hemandez NA，Romero JL，Caceres SA，et al. Alteration of fibrinolysis in stroke[J]. Europe PMC，1996，13(3)：107-110.

[10]González GE，Rhaleb NE，D’Ambrosio MA，et al. Cardiac-deleterious role of galectin-3 in chronic angiotensin II-induced hypertension[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2016，311(5)：H1287-H1296.

[11]Hess DC，Zhao W，Carroll J，et al. Increased expression of ICAM-1 expression associated with inflammatory cell response in human ischemic stroke[J]. Circulation，1996，94(5)：939-945.

Effects ofHypaconitine on neurological function，and t-PA and PAI-I levels in serum in cerebral infarction rats

LIANGHuafeng，XIEJing，SHENJing，etal.

(DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

Objective Ctive：To investigate the effects of Hypaconitine (HA) on neurological function，and t-PA and PAI-I levels in serum in cerebral infarction rats. Methods Rats were randomly divided into the following groups：sham group，cerebral infarction (CI) group，low dose treatment (HA-L) group，media dose treatment (HA-M) group and high dose treatment (HA-H) group. After establishment of cerebral infarction model，rats were

with 0.25 mg/kg，0.75 mg/kg or 2.25 mg/kg of HA by gavage once a day for 3 days. The impairment of neurological function was scored，the levels of t-PA and PAI-I were measured with ELISA，the cerebral infarction volume was analyzed by TTC staining，and ICAM-1 and VCAM-1 protein expression were determined by Western blotting. Results Compared with CI group，HA treatment significantly improved neurological function and decreased the levels of t-PA and PAI-I in serum. Moreover，HA treatment also reduced the cerebral infarction volume and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1.Conclusion HA can protect against neurological function impairment in cerebral infarction rats via inhibition of t-PA and PAI-I levels and ICAM-1 and VCAM-1 expressions.

Hypaconitine； Cerebral infarction； Plasminogen； ICAM-1； VCAM-1

1003-2754(2017)07-0625-03

2017-03-10；

2017-06-20

(新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院神經內科，新疆 石河子 832000) 通訊作者：梁華峰，E-mail：xiehuafengmed@126.com

R743.3

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