蛋白激酶PLK4對人腦膠質(zhì)瘤增殖的影響*

張作鑫 周俊虎 韓磊

·基礎(chǔ)研究·

蛋白激酶PLK4對人腦膠質(zhì)瘤增殖的影響*

張作鑫 周俊虎 韓磊

目的：分析蛋白激酶PLK4表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后相關(guān)性以及對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響。方法：基于CGGA數(shù)據(jù)庫評估PLK4表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級別和預(yù)后的關(guān)系；構(gòu)建靶向PLK4基因的小分子干擾RNA，運(yùn)用qPCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率；利用MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評價PLK4對腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果：PLK4的表達(dá)水平隨樣本病理級別的上升而增加，并且與膠質(zhì)瘤患者總生存期和高級別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后緊密相關(guān)；MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低PLK4表達(dá)后腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱。結(jié)論：PLK4的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后緊密相關(guān)，并能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖活性。因此，PLK4可能是膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤 蛋白激酶 PLK4 增殖

PLK4是Polo樣蛋白激酶家族中的一員，與該家族其他蛋白激酶不同，其羧基端僅有1個Polo結(jié)合域，該蛋白是調(diào)節(jié)中心粒擴(kuò)增以及有絲分裂的1個關(guān)鍵因子［1］。研究表明，在正常增殖的細(xì)胞中，PLK4是一種處于低水平表達(dá)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，而在乳腺癌等許多腫瘤中，PLK4的活性明顯異常［2］。PLK4蛋白的異常表達(dá)可能導(dǎo)致中心粒數(shù)目及結(jié)構(gòu)的異常，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞有絲分裂能力的改變。同時，PLK4還可能是預(yù)測腫瘤患者預(yù)后的一個因子［3］。然而，PLK4在人腦惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況以及與患者預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。本研究基于CGGA患者樣本數(shù)據(jù)庫分析PLK4表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級別及預(yù)后的相關(guān)性和RNAi敲低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PLK4表達(dá)后分析腫瘤細(xì)胞增殖能力的變化，從而探討PLK4與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后以及對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膠質(zhì)瘤樣本數(shù)據(jù)庫使用CGGA mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫（http：//www.cgcg.org.cn），其中患者標(biāo)本Ⅱ級121例，Ⅲ級50例，Ⅳ級127例。分析不同級別患者組織樣本中PLK4的表達(dá)情況，并根據(jù)PLK4的表達(dá)水平分析患者生存期并繪制Kaplan-Meier曲線。

1.1.2 主要試劑靶向PLK4的siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司代為構(gòu)建。序列1：5'-ACTCCTTTCAGA CATATAAG3'；序列2：5'-AACTATCTTGGAGCTTTATA A-3'；NC序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGC-3'。人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系：U87、U251、LN229和人胚腎細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。U87Ⅷ細(xì)胞系為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)任歡教授饋贈，由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM、MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；Trizol RNA提取及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；RT-qPCR系統(tǒng)試劑盒購自美國Promega公司；PLK4抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體及辣根酶標(biāo)記二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL檢測系統(tǒng)及PVDF膜購自美國Milipore公司；MTT粉末、4%多聚甲醛、結(jié)晶紫染液、DMSO均購自北京索萊寶生物科技公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國NEST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)U87、LN229、U87Ⅷ、HEK293T采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、U251采用含10%的MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組陰性對照處理組（negative con?trol），siRNA序列1處理組（PLK4 RNAi 1#），siRNA序列2處理組（PLK4 RNAi 2#）。轉(zhuǎn)染前1 d，取6孔板，每孔種植細(xì)胞2×105個/mL，過夜培養(yǎng)。待第2天細(xì)胞密度為70%～90%時，吸棄培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基1 mL/孔，按照產(chǎn)品說明加入相應(yīng)量轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectamine 3000及siRNA，6 h后換新鮮含10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24～48 h后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.3 qPCR法分析PLK4 mRNA表達(dá)水平采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃，60 min條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，加入特異性PLK4基因引物，進(jìn)行PLK4基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，以GAPDH基因作為內(nèi)參照。PLK4上游引物序列：5'-GACACCTCAGA CTGAAACCGTAC-3'；下游引物序列：5'-GTCCTTCT GCAAATCTGGATGGC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'；下游序列：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。

1.2.4 Westernblot法測定PLK4蛋白水平的變化轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用RIPA裂解液提取總蛋白，加熱煮沸使蛋白變性，80 V下電泳90 min，冰浴中80 V轉(zhuǎn)膜90 min。37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜（1∶1 000），二抗室溫孵育1 h（1∶2 000）。ECL檢測系統(tǒng)根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖將膠質(zhì)瘤細(xì)胞以3×103/mL的密度接種于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)8個復(fù)孔。根據(jù)Lipofectamine 3000產(chǎn)品說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。37℃，5%CO2溫箱孵育。從轉(zhuǎn)染后第1天開始，以后每天固定時間取出96孔板，于相應(yīng)孔中加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），共計5 d。37℃條件下再培養(yǎng)4 h，棄上清，加DMSO 150 μL/孔，搖床震蕩20 min，酶標(biāo)儀測490 nm波長各孔吸光值。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞、計數(shù)，以2×102/mL接種于6孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，加入含血清培養(yǎng)基2 mL。37℃、5%CO2溫箱孵育2～3周，每周固定換液。鏡下觀測到每個單克隆含有50個以上細(xì)胞時終止培養(yǎng)，以4%多聚甲醛固定30 min，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，計數(shù)平板上各組細(xì)胞形成的肉眼可見的克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。圖像分析應(yīng)用Bandscan軟件、采用方差分析、χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤患者中PLK4的表達(dá)水平與患者病理級別和預(yù)后的相關(guān)性分析

通過對CGGA數(shù)據(jù)庫中298例不同級別國人膠質(zhì)瘤樣本mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，PLK4 mRNA的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級別呈正相關(guān)；總體生存期分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)PLK4的患者總生存期較高表達(dá)PLK4的患者明顯延長（P＜0.000 1），并且在高級別膠質(zhì)瘤患者中PLK4表達(dá)與患者預(yù)后明顯相關(guān)（P＜0.000 1），但是在低級別膠質(zhì)瘤患者中，PLK4表達(dá)與患者預(yù)后無顯著性相關(guān)（P＞0.05，圖1）。

2.2 不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系PLK4 mRNA表達(dá)水平

應(yīng)用qPCR方法對4種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblasto?ma，GBM）細(xì)胞系PLK4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析（圖2）。與對照組（HEK293細(xì)胞系）相比，PLK4在U87細(xì)胞系中的相對表達(dá)量約為對照組細(xì)胞的4.42倍，在LN229、U251和U87Ⅷ細(xì)胞系中PLK4的相對表達(dá)量分別為對照組細(xì)胞的3.76、2.84和1.53倍。2.3qPCR檢測RNAi后目的基因mRNA水平的表達(dá)

應(yīng)用qPCR方法對U87、LN229細(xì)胞系PLK4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析（圖3）。U87細(xì)胞系中，與NC組相比，2個siRNA序列敲低PLK4表達(dá)后，PLK4 mRNA的相對表達(dá)量分別為對照組的0.54倍（RNAi 1#）和0.26倍（RNAi 2#）；LN229細(xì)胞系中，與NC組相比，2個siRNA序列敲低PLK4表達(dá)后，PLK4 mRNA的相對表達(dá)量分別為對照組的0.41倍（RNAi1#）和0.17倍（RNAi 2#）。

2.4 Western blot檢測RNAi后目的基因蛋白水平的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87細(xì)胞系中，RNAi 1#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.35倍；RNAi 2#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.14倍；LN229細(xì)胞系中，RNAi 1#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.58倍；RNAi 2#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.35倍（圖4）。表明與NC組細(xì)胞相比，兩個RNAi處理組細(xì)胞中PLK4蛋白的表達(dá)量顯著降低。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn)

MTT分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U87和LN229細(xì)胞系中，與NC組細(xì)胞相比，RNAi 1#和2#處理組細(xì)胞自第2天起增殖能力顯著減弱（圖5），且各組之間增殖速率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明敲低PLK4后腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱。

2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U87細(xì)胞系中，NC組細(xì)胞形成集落51個，RNAi 1#處理組細(xì)胞形成集落30個，RNAi 2#處理組細(xì)胞形成集落17個；LN229細(xì)胞系中，NC組細(xì)胞形成集落70個，RNAi 1#處理組細(xì)胞形成集落30個，RNAi 2#處理組細(xì)胞形成集落24個，兩種細(xì)胞形成集落能力明顯低于NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），表明敲低PLK4后腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱（圖6）。

圖1 CGGA數(shù)據(jù)庫分析PLK4表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級別和生存期的關(guān)系Figure 1Correlation of PLK4 expression with the survival of patients with glioma of different pathological grades was analyzed using the CGGA dataset

圖2 利用qPCR檢測不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PLK4 mRNA的表達(dá)水平Figure 2PLK4 expression levels in different glio‐ma cell lines were measured by qPCR analysis

圖3 qPCR法檢測各處理組細(xì)胞PLK4基因mRNA水平的變化Figure 3PLK4 mRNA levels in several treated groups were determined by qPCR analysis af‐ter silencing PLK4 with siRNAs

圖4 Western blot檢測各處理組細(xì)胞PLK4基因蛋白水平的變化Figure 4PLK4 protein levels in treated groups were detect‐ed by Western blot analysis

圖5 MTT法分析各處理組細(xì)胞的增殖活力Figure 5Proliferation of cells in treated groups was analyzed by MTT assay

圖6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各處理組細(xì)胞的增殖活力Figure 6Glioma cells were transfected with PLK4‐targeted siRNAs and subjected to colony formation assay to assess proliferation ability

3 討論

蛋白激酶是一類能夠催化ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子中如絲氨酸、蘇氨酸殘基羥基、酪氨酸殘基酚羥基等氨基酸殘基上的磷酸轉(zhuǎn)移酶。蛋白質(zhì)的磷酸化及去磷酸化可以導(dǎo)致細(xì)胞生物信號的啟動及傳遞，而細(xì)胞中信號異常通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及改變則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［4］。研究發(fā)現(xiàn)激酶與惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)［5］，激酶還可以調(diào)節(jié)DNA甲基化［6］，組蛋白修飾［7］，染色質(zhì)重構(gòu)［8］，在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展中也發(fā)揮著重要的作用。PLK4是繼PLK1-3發(fā)現(xiàn)之后又1個Polo樣蛋白激酶，其定位于中心粒上，與中心粒的擴(kuò)增有著密切的聯(lián)系［9］。中心粒的穩(wěn)定和正常復(fù)制在保持遺傳的穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)聯(lián)系細(xì)胞其他活動中起著關(guān)鍵作用［10］；細(xì)胞有絲分裂啟動后，位于母中心粒上的PLK4蛋白激活，促使下游調(diào)控因子Sas-6、γ-tubulin、CEP-135、CP110等蛋白募集到母中心粒上完成中心體的組裝，使中心體逐漸成熟［11］。通常情況下，在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)變期，以母中心粒為模板進(jìn)行中心粒復(fù)制，在G2/M轉(zhuǎn)變期，中心粒成熟，在有絲分裂前期，中心體逐漸移向細(xì)胞兩極，隨著細(xì)胞分裂，每個子代細(xì)胞獲得一個中心體，從而完成有絲分裂。腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生中心粒結(jié)構(gòu)與數(shù)目的異常，常常伴隨著細(xì)胞分裂的缺陷與基因組的不穩(wěn)定［12］。中心粒的異?？梢詫?dǎo)致染色體分裂紊亂，干擾細(xì)胞正常活動，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Habedanck等［13］發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤U2OS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型PLK4后，細(xì)胞內(nèi)中心粒數(shù)目＞2個，而轉(zhuǎn)染催化失活型PLK4的細(xì)胞僅2個中心粒；用RNAi技術(shù)敲低人宮頸癌HeLa細(xì)胞中PLK4基因時，中心粒少于2個的細(xì)胞比例明顯增多，由此推測抑制PLK4的活性可能會使細(xì)胞的增殖能力減弱。

本研究對中國人膠質(zhì)瘤CGGA mRNA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PLK4 mRNA的表達(dá)與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)，并與膠質(zhì)瘤患者和高級別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)使用RNAi技術(shù)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中敲低PLK4表達(dá)后，通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力明顯減弱，因此蛋白激酶PLK4可能是膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。但是PLK4被敲低后，引起惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的下降所涉及的分子機(jī)制目前還鮮有報道，其是否通過參與腫瘤細(xì)胞中心粒擴(kuò)增進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)展和有絲分裂，及其與其他腫瘤生物學(xué)惡性表型的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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（2017‐03‐15收稿）

（2017‐05‐11修回）

Effect of kinase PLK4 on the proliferation of glioma cells in vitro

Zuoxin ZHANG,Junhu ZHOU,Lei HAN

Lei HAN;E‐mail:superhanlei@hotmail.com
Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Lab of Neuro‐Oncology,Tianjin Neurological Institute,Key Laboratory of Post‐Neuro‐Injury Neuro‐Repair and Regeneration in Central Nervous System,Ministry of Education and Tianjin City,Tianjin 300052,China

Objective:To analyze the correlation of protein kinase PLK4 with the prognosis of patients with malignant glioma and the proliferation of human glioblastoma cells.Methods:The relationship of PLK4 expression to the pathological grade and prognosis was evaluated using CGGA datasets.Designated siRNAs targeting PLK4 were constructed,and the silencing effect was identified by RT‐qP‐CR and Western blot analyses.The effect of PLK4 on the proliferation of tumor cells was evaluated by MTT and colony formation as‐says.Results:The expression of PLK4 increased with pathological grade and was significantly related to the overall survival in patients with glioma and the prognosis of patients with high‐grade glioma.MTT and colony formation assay results indicated that the prolifera‐tion activity was significantly reduced after depleting PLK4.Conclusion:The expression of PLK4 is related to the prognosis of patients with glioma and can affect the proliferation activity of tumor cells.Therefore,PLK4 could be a potential therapeutic target in glioma treatment.

glioma,kinase,PLK4,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.300

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，天津市神經(jīng)損傷變異與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部中樞創(chuàng)傷修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300052）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81572496）資助

韓磊superhanlei@hotmail.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81572496)

張作鑫專業(yè)方向?yàn)槟z質(zhì)瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

E-mail：823432117@qq.com